免疫學檢驗——免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術

　　第一節

　　免疫細胞的分離

　　一、外周血單個核細胞的分離

　　將2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液與1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液混合，其比重為1.077±0.002，可作為常規的淋巴細胞分離液，即Ficoll分離液。

　　主要用于分離外周血中單個核細胞，是一種單次密度梯度離心分離法，其分布由上到下依次為：稀釋的血漿層、單個核細胞層、粒細胞層和紅細胞層。

　　二、淋巴細胞的分離

　　純淋巴細胞群的采集是利用單核細胞在37℃和Ca2＋存在時，能主動黏附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，從單個核細胞懸液中除去單核細胞，從而獲得純淋巴細胞群。

　　1.黏附貼壁法

　　2.吸附柱過濾法

　　3.磁鐵吸引法

　　4.Percoll分離液法

　　三、T細胞和B細胞的分離

　　1.E花環沉降法

　　2.尼龍毛柱分離法

　　四、T細胞亞群的分離

　　1.親和板結合分離法

　　2.磁性微球分離法

　　3.熒光激活細胞分離儀分離法

　　五、分離細胞的保存

　　1.短期保存技術

　　將分離的細胞用適量含10%～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養液稀釋重懸。短期保存可置于4℃保存。

　　2.長期保存技術

　　液氮深低溫（-196℃）環境保存細胞，加入二甲亞砜作為保護劑。

　　六、分離細胞的活力測定

　　活力測定最簡便常用的為臺盼藍染色法。

　　這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內，使死細胞著色呈藍色，通過死亡細胞與活細胞的百分比可反映細胞活力。

　　七、不同細胞分離方法的綜合評價

　　早期的免疫細胞分離技術主要是根據不同免疫細胞的物理屬性（如比重不同）和生物學屬性（如黏附力不同）進行分離，用目前的標準看，其分離的靈敏度或分辨率都不高。作為一種傳統的分離手段其分離效果已被認可，如用單個核細胞進行的某些實驗，一般被認為可以代表淋巴細胞，無特別需要一般并不采用分離純化淋巴細胞的替代技術。作為富集某一類細胞的手段，傳統的方法仍不失為簡便和行之有效的技術，而且傳統，如Percoll連續密度離心法仍可得到非常理想的細胞分離效果，但Percoll法分離流程長，手續繁多，若無特殊需要很少采用。

　　傳統的細胞分離技術主要采用離心法，利用密度梯度原理進行分離，時間長、效果差。近期發展起來的細胞分離技術大多是基于利用細胞表面標志（抗原或受體）進行細胞分離，較早出現的技術以細胞親和層析為代表。隨后出現細胞固相包被技術，細胞淘洗技術，同時還有流式細胞儀分離技術，磁性微球分離法。這些技術的出現使細胞分離技術產生了實質性的進步。目前這類技術主要用于科研，在常規臨床實驗室中并未廣泛應用。另外這類技術所依賴的設備和試劑價格昂貴，目前尚不能完全替代經典的細胞分離技術。

　　第二節

　　淋巴細胞標志及亞群分類

　　一、T細胞表面標志及其亞群

　　所有的T細胞均有共同的標志性抗原，一般認為是CD3。CD3＋CD4＋CD8－輔助性T細胞（Th）CD3＋CD4－CD8＋細胞毒性T細胞（Tc或CTL） CD4＋CD25＋ 調節性T細胞（Tr或Treg） CD2

　　表達于全部人T細胞和NK細胞表面，因其能與綿羊紅細胞（SRBC）結合，又稱為綿羊紅細胞受體。

　　CD3

　　是一種多鏈的糖蛋白，表達于全部T細胞表面，是T細胞的表面標志，是TCR-CD3復合物的重要組成部分。

　　CD4／CD8

　　CD4和CD8分子分別表達于外周血不同的T細胞亞群表面，是區分T細胞亞群的重要標志。表達CD4的主要是輔助性T細胞，表達CD8的主要是細胞毒性T細胞。其他表面標志：致有絲分裂受體、病毒受體。

　　（一）輔助性T細胞

　　輔助性T細胞的典型表面標志是CD3＋CD4＋CD8－。已證明不同的輔助性T細胞株所產生的細胞因子不盡相同，因而認為體內至少存在兩種輔助性T細胞（Th1，Th2）。研究表明，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等細胞因子輔助細胞免疫或參與遲發型超敏反應，本身具有明顯的細胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等細胞因子輔助體液免疫，參與速發型超敏反應，但本身不具有明顯的細胞毒作用。

　　（二）細胞毒性T細胞

　　細胞毒性T細胞的典型表面標志是CD3＋CD4－CD8＋。與輔助性T細胞類似，細胞毒性T細胞也可以分泌細胞因子，而且不同的細胞株所產生的細胞因子也不盡相同，分泌細胞因子的特征與Th1和Th2十分相似，遂將細胞毒性T細胞再細分為Tc1與Tc2，Tc1與Tc2都有典型的細胞毒性效應。

　　（三）調節性T細胞

　　目前認為調節性T細胞主要包括兩個亞群，一種是CD4＋CD25＋調節性T細胞；另一種為CD8＋調節性T細胞，其主要包括CD8＋CD28－調節性T細胞和CD8＋Qa-1限制性的調節性T細胞。

　　二、B細胞表面標志

　　B細胞表面的膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受體、補體受體、EB病毒受體和小鼠紅細胞受體是B細胞的重要表面標志。膜免疫球蛋白（mIg）又稱為BCR，表達于所有成熟的B細胞和大多數B細胞瘤的細胞表面，屬于免疫球蛋白超家族原型，是B細胞最具特性的表面標志。

　　mIg的主要作用是結合特異性抗原，故又稱為抗原受體。

　　成熟B細胞的mIg主要為mIgM和mIgD。

　　B細胞及其亞群的檢測是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調節紊亂的重要指標。

　　三、NK細胞表面標志

　　人類NK細胞表面標志：CD16、CD56。

　　CD16分子又稱為低親和性IgG Fc受體，當IgG類抗體與靶細胞表面相應抗原表位特異性結合后，可通過其Fc段與NK細胞表面FcRⅢ結合，行使針對靶細胞的定向非特異性殺傷作用，也即NK細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）。

　　第三節

　　其他的免疫細胞

　　其他的免疫細胞包括髓系細胞，如單核-巨噬細胞以及中性粒細胞等，特別是抗原提呈細胞尤為重要。

　　抗原提呈細胞（APC）指能攝取、加工、處理抗原，并將抗原提呈給抗原特異性淋巴細胞的一類免疫細胞。

　　抗原提呈細胞可分為兩類：

　　①“專職”抗原提呈細胞，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞，它們均可表達MHC-Ⅱ類分子。

　　②“非專職”抗原提呈細胞，包括內皮細胞、上皮細胞和激活T細胞等，它們在某些因素刺激下可表達MHC-Ⅱ類分子，并具有抗原提呈功能。

　　所有表達MHC-Ⅰ類分子并具有提呈內源性抗原能力的細胞，廣義上也屬于抗原提呈細胞。

　　一、單核-吞噬細胞系統

　　單核-吞噬細胞系統（MPS）包括骨髓內的前單核細胞、外周血中的單核細胞和組織內的巨噬細胞。

　　單核-吞噬細胞的典型的表面標志是CD14。

　　二、樹突狀細胞

　　樹突狀細胞（DC）是一大類專職抗原提呈細胞，其主要有兩種來源，即髓系和淋巴系。

　　DC是形態、表型和功能高度異質的細胞。

　　根據刺激T細胞增殖能力的不同，它們被分為成熟和不成熟的DC。

　　根據誘導T細胞分化為不同效應T細胞的功能，將它們分為誘導分化Th1的DC（DC1）和誘導分化Th2的DC（DC2）。

　　根據明顯的譜系和細胞表型的不同，分為髓系DC和淋巴DC。

　　人成熟DC的主要特征表面標志為CD1a、CD11c和CD83。

　　第四節

　　免疫細胞表面標志的檢測及應用

　　一、免疫細胞表面標志的檢測方法

　　（一）抗體致敏細胞花環法

　　（二）免疫細胞化學法

　　通常以酶作為抗體標志物，采用細胞酶免疫組織化學技術完成（詳見第十三章），并常采用生物素-鏈霉親和素放大系統提高靈敏度。該類方法可用普通顯微鏡觀察，凡著色的細胞即為相應CD抗原陽性的細胞，計算陽性細胞占總計數細胞的百分率進行定量分析。本法簡便易行，不需特殊儀器，一般實驗室均可采用。

　　（三）免疫熒光法

　　本法是將分離得到的外周血單個核細胞與相應的以熒光素標記的CD單克隆抗體作用（直接法），或與抗相應CD單克隆抗體作用后，洗去游離的抗體，再加入熒光素標記的抗小鼠IgG抗血清，經溫育結合后，洗去多余的標記抗體（間接法），制片后用熒光顯微鏡觀察結果，計算陽性細胞占總計數細胞的百分率。

　　（四）流式細胞分析法

　　目前免疫細胞的檢測主要采用流式細胞術，結果客觀準確，重復性好。

　　二、淋巴細胞表面標志檢測的臨床意義

　　淋巴細胞表面標志檢測是評價免疫功能的重要指標。由于淋巴細胞，特別是T淋巴細胞在執行免疫功能方面發揮多種作用，故有必要對各類淋巴細胞（淋巴細胞亞群）進行分析。這中間主要是通過表面標志識別進行計數。

　　在評價免疫功能時經常采用CD4／CD8比值。如CD4是HIV受體，HIV感染時CD4／CD8比值明顯降低。但CD4陽性細胞包括了很多功能性細胞，如TH、Tr等，CD8陽性細胞也是如此，所以單用CD4／CD8比值反映免疫功能顯然不夠準確。除AIDS患者外，實際觀察CD4／CD8比值與患者的免疫功能及臨床癥狀的關系及意義有限。

　　對CD4＋和CD8＋T細胞的測定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應的監測。CD4／CD8升高常見于自身免疫性疾病；而CD4／CD8降低常見于病毒感染、惡性腫瘤和再生障礙性貧血等。

　　在使用淋巴細胞計數資料時應特別注意淋巴細胞計數所采用的方法，因為不同的方法所得到的結果差別很大，特別是目前對淋巴細胞檢測方面尚無高水平的質控以及質控標準，所以不同實驗室的檢測結果可比性差。標本處理方法不同、實驗條件不同及鏡檢計數者不同都會對結果產生較大的影響。流式細胞儀檢測最大限度地減少了上述影響，但在設定有關參數、定義細胞群等方面仍會受到檢測者經驗的影響。

　　淋巴細胞的活性在不同的情況下可以有很大的差別，而數量的差別很少有如此之大，因此，常采用淋巴細胞計數反映機體免疫狀況。但淋巴細胞計數只是對有關淋巴細胞的數量進行分析，并不能完全代表淋巴細胞的功能，所以還應結合對淋巴細胞的功能檢測綜合判定其臨床意義。