（2） ELISPOT 技術的現在
1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術改良，ELISPOT 分析技術已經逐漸達到科研人員的期待，它已是當世公認最靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術可提示T細胞免疫系統的兩個重要參數：抗原特定T細胞的clone族群大小；和免疫效應細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。
多年來經過數十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術本身的幾個問題，也有了科學上的驗證。目前一般公認，ELISPOT技術允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經由CD4或者CD8細胞的免疫反應。在適當的實驗設計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學信息，闡明免疫調節藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產能，而ELISPOT技術能提供雙份信息。
ELISPOT分析技術的幾個特點已經讓它在抗原特定T細胞免疫學上獨占鰲頭。此技術是當世唯一準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術也望其項背，以目前國內外常規的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環系統發生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術被證實適用于冰凍后復蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當的效價，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構，病人血樣可冰存并同時集中在「中央實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標準對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利ELISPOT Cytokine技術流程的規范化、標準化。
（3） ELISPOT 未來展望
ELISPOT 分析技術正在歐美各國發揮它的完整潛能，它讓免疫學家可以直接洞察活體內T細胞相關生理學或病理學，就像是心臟外科醫師手上的那張心電圖，經由這個技術科研人員可以在活體內直接進入一個器官系統，在那里視察、發掘，得到全新的智識。
從各國文獻可見ELISPOT技術已經達到標準化、規范化的要求，并被廣泛地應用在多項領域，包括監視癌癥病人接受免疫療程時的反應(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫病人體內的一個特定的免疫反應型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術同時也在數個疫苗效價評估人體試驗中，被當成重要的終結指針。2003年1月，世界衛生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應用ELISPOT技術來監測HIV疫苗研究免疫應答反應技術，該計劃將是首次利用ELISPOT技術對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關研究。我們期待未來此技術能在我國免疫學界得到廣泛地應用。
原理
ELISPOT就其原理來說實在是很簡單的，從本質上說和ELISA的原理是一樣的，理解起來并不難。細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過ELISPOT 酶聯斑點分析系統對斑點的分析后得出結果。傳統的ELISA與ELISPOT都是根據酶免疫學檢測原理，通過酶的高催化頻率，放大反應效果，從而達到很高敏感度的檢測效果。
ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下染色斑點。
反應步驟可大致分為：
（1） 利用特定細胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點；
（2） 加入細胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細胞，產生細胞因子，細胞因子會往附近擴散與之前包被的抗體進行特異結合；
（3） 洗掉細胞；
（4） 加入酶標二抗特異與細胞因子進行結合，通過底物的顯色反應，一個細胞所在位置就會顯出斑點，最后利用顯微鏡或者特定的讀板機（reader）就可以計算出樣品中被激活細胞的數目。
以上是檢測分泌細胞因子細胞的流程，如果是檢測分泌特異抗體的細胞只需把包被特異抗體變為包被特異抗原即可。
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ELISPOT技術實驗步驟
從原理上看ELISPOT的確很簡單，但是在操作過程中有許多條件需要摸索，所以這里進一步介紹一下ELISPOT的操作步驟。
（1） 將適量捕獲性抗體預先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4℃孵育過夜。將板用PBS洗6遍，再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養基封閉，室溫下孵育至少1h。FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應。有一種特殊的96孔板底面介質是PVDF膜，利用膜的多孔結構可以讓單個細胞坐到其中，然后分泌細胞因子或特定抗體，這樣使最后的檢測單個細胞靈敏度成為可能。同時，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELISA的不同之處。理論上是可以同時包被兩個不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統顯出不同顏色，但是這樣就要考慮到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數量要足夠。如果是使用試劑盒的預包被板，這一步就可以省略啦。
（2） 將陰性對照和細胞樣品，如外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經純化的CD8+T細胞或去除某種特異細胞群的PBMC，用含10%FCS的培養基稀釋至5×104～2×105個/孔如果條件可以達到更高的細胞數，建議可以嘗試3×105～5×105個/孔，特別是在分泌細胞），分裝于ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達產物，提取的抗原等，陰性對照孔中只加入培養基（實驗中最好采用無血清的培養基，這樣可以避免因為血清批次不同的差異所造成的誤差，同時也避免血清的某些成份會引起非特異的反應），陽性對照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或陽性多肽，37℃，體積比為5% CO2培養24～48h。要進行ELISPOT實驗的細胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測是十分靈敏的，頻率低至10-12的分泌細胞都可以被檢測出來。并且對于那些會貼壁的細胞也可以使用此種方法，雖然細胞生長貼壁后不易被洗去，但是不會妨礙最后斑點的顯色。只要細胞可以正常分泌與抗體特異結合的產物，這些產物會逐步擴散到細胞四周，最后還是可以顯示出斑點。