ELISPOT 實驗方案
對應BD的試劑盒
實驗材料的準備
試劑盒中沒有但是必須的
材料:
? 已消毒的移液器 (Gilson)。單道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul
? 無菌一次性聚苯乙烯吸量管 (1ml, 5ml, 10ml）(Axygen)。
? 一次性乳膠手套 。
? 無菌一次性離心管（15ml、50ml）(Corning cat#430052 and 430290)。
? 吸水紙(衛生紙)
? 無菌tip頭, 200ul,1ml,
試劑:
1. PBS 無菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在準備包被抗體時不要使用商業化的PBS
2. ddH2O(無菌) 對于10塊ELISPOT板，200 ml
3. 有菌洗滌緩沖液(PBST)：有菌3000ml/10板
Tween-20 進口
4. 有菌洗滌緩沖液(PBS)：有菌1000ml/10板
5. 培養液：無血清培養基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。
6. PMA ＋ionomycin.
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended).
PMA
貯 存 液：PMA溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存
工 作 液：貯存液 1:4000稀釋于無血清培養基中
此時為 250ng/ml
Calcium ionophore (ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended).
Ionomycin
貯 存 液：Ionomycin溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存
工 作 液：貯存液 1:200稀釋于無血清培養基中
此時為 5μg/ml
50ml混合刺激劑＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，無血清培養基補齊
7. 10% 熱滅活胎牛血清 (Hyclone cat# ALH14384 )
8. 抗原
設備:
? 洗板器: 自動或手動 (洗瓶, 手動分液器等)。
?專用CO2-細胞培養箱 (37°C)。
4°C冰箱
無菌間無菌操作臺
Preparation kit reagents
1．包被用抗體
取50 μl加到10ml PBS中。（足夠包被1塊96孔板，100 μl/well）。
對10塊板子， 500ul加到100ml PBS中
2．生物素標記的檢測抗體（detector antibody）
取50μl加到10 ml Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/well）。
對10塊板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer(PBS+10%FBS)
3．STREP-HRP
取100μl加到10 ml Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。
對10塊板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer
4 顯色激活系統（Activation system）
對于1塊ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，10分鐘內用完。（100 μl/孔）。
ELSPOT實驗步驟
Day 1
包被ELISPOT板 16：30
1. 在ELISPOT板中每孔加入包被抗體100μl，4℃ 過夜。
Day 2
ELISPOT板的封閉 17：00
2. 取出已包被的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。
3. 用完全無血清培養基洗1次。
4. 在ELISPOT板中，每孔加入200μl完全無血清培養基。室溫2h。(8道排槍)
5.
PBMC加入ELISPOT培養板 20：00