現以國產對硫磷農藥酶聯免疫抗體制備及ELISA方法為例做一介紹。
(1)對硫磷(1605)農藥的酶聯免疫分析 對硫磷與其他的有機磷農藥一樣,都屬于小分子物質,必須與大分子物質(如蛋白質)聯結,才能用作免疫原。農藥的抗體制備和免疫分析方法與其他小分子物質類似,讀者可以查閱到很多相關資料。
①免疫抗原的合成 對硫磷先在濃鹽酸和金屬還原劑(Zn/Fe)的作用下將苯環上一硝基還原成氨基,經過重氮化后與牛血清白蛋白(BSA)聯結。純化聯結物,在紫外可見分光光度計上掃描以鑒定半抗原的聯結情況。
②包被抗原的合成 方法與免疫抗原的制備方法基本相同,只是把載體蛋白BSA改為卵清白蛋白(OVA)。
③抗體的制備與純化
a.免疫動物 初次免疫,用一定量的免疫抗原與等量的完全弗氏佐劑混合乳化,大腿肌肉注射3～4只體重1.5kg左右的白兔。以后每隔2周進行一次加強免疫,加強免疫用不完全弗氏佐劑,皮下注射。從第二次加強免疫開始,每次免疫后約10天從耳靜脈采少量血液,以監測抗體效價。
b.抗體效價的驗證第5次加強免疫后,抗體效價即可達到所要求的水平。頸動脈采全血,離心、分裝、凍存。用PBS緩沖液10倍稀釋,以包被抗原包被酶標板,用ELISA法檢測抗血清效價。
c.抗體純化抗血清先用50%飽和硫酸銨沉淀再用DEAE-52分離IgG。
④免疫測定條件的篩選及標準曲線的建立
a.包被:將包被抗原按照一定的稀釋倍數稀釋,100微升/孔加到酶標板上,在37℃或4℃下包被一定時間。
b.洗板:洗板四次,第一次迅速倒掉,以后每次放置約1min再倒掉,洗完后在吸水紙上將板甩干。
c.競爭:加標樣或樣品50微升/孔,加抗體50微升/孔。
d.洗板:同上操作。
e.加酶標二抗(IgG-HRP):IgG-HRP按一定倍數稀釋,100微升/孔加入酶標板。溫育條件為37℃、30min。
f.洗板:洗板五次,方法同上。
g.顯色:加100微升/孔顯色液,底物現配現用,當最大濃度孔與0孔之間OD值相差最大時終止顯色。
h.終止:用3mol/LH2SO4終止,50微升/孔。
按照以上步驟,用方陣法篩選最佳溫育時間、溫度及包被抗原、抗體濃度,建立標準曲線,確定最小檢測極限以及抗體與其他有機磷農藥的交差反應。
⑤樣品測定與驗證 稱取1g白菜樣品三份,分別添加250ng,500ng,1000ng的對硫磷標樣,用5ml甲醇磨樣提取過夜,400r/min離心。取上清液,一半用于GLC測定,一半用氮氣吹干,再用0.5mL樣品緩沖液定容,ELISA測定。
⑥實驗結果對硫磷抗體 ELISA效價為1:8000倍,標準曲線方程為Y=-1.32X+7.14,相關系數為0.9733,其最小檢測限為62.5ng/mL.當標樣中的濃度分別為250ng,500ng,1000ng時,ELISA測定的回收率分別為88.4%,90.2%,93.5%,GLC測定的回收率分別為94.0%,96.8%,95.8%,說明 ELISA測定結果是可靠的。對硫磷抗體與甲基對硫磷、甲胺磷、馬拉硫磷、久效磷和氧樂果五種常用有機磷農藥的交差反應值都很小(<1%)。
用上述方法制備的對硫磷抗體免疫效價和檢測極限并不高,這主要是由于所采用的免疫抗原制備方法的限制。如果在載體蛋白與對硫磷半抗原之間加一連接橋,可能獲得效價高的抗體,且提高檢測極限。