免疫沉淀常見問題及對應解答

免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。免疫沉淀要求抗原的純度盡可能提高。降低本底，用不與待檢抗原結合的非特異性抗體預處理，可以從抗原溶液中除去非特異性結合蛋白，即此法次是用非免疫抗體降低本底，第二次再用所研究的抗體，這樣進行二次免疫沉淀是達到純化免疫沉淀物*有效的方法。今天上海勁馬實驗將為大家分享一些免疫沉淀的常見問題及對應解答！

1. 用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實驗？ 

答：抗體的性質對免疫沉淀實驗影響很大。抗體不同，和抗原以及Protein G或Protein A的結合能力也就不同。所以一般免染能結合的抗體未必能用于IP反應。 一般來說，多抗是沉淀反應的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。

2. 為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？ 

答：從活性細胞裂解出來的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預檢測蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進行實驗。

3. 溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？ 

答：多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合。

4. 免疫沉淀實驗應如何把握抗體和緩沖液的比例？ 

答：每次沉淀實驗之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。

5. 免疫沉淀應該如何配制細胞裂解液？ 

答：適當的細胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC（sodium de-oxycholate），SDS是離子性的強活性劑。所以裂解液的配制時所用去污劑的種類和濃度以及鹽濃度等條件需實驗者進行優化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體完全失去活性。