免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）實驗方法

基本實驗步驟

（1）收獲細胞，加入適量細胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g離心30 min后取上清；

（2） 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；

（3）免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 g速度離心5 min,將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；

（4）SDS-PAGE, Western blotting或進行質譜分析。

一、 樣品處理：

免疫沉淀實驗成功與否，第一步處理樣品非常關鍵。

免疫沉淀實驗本質上是處于天然構象狀態的抗原和抗體之間的反應，而樣品處理的質量決定了抗原抗體反應中的抗原的質量，濃度以及抗原是否處于天然構象狀態。

所以制備高質量的樣品以用于后續的抗體-agarose beads孵育對免疫沉淀實驗是否成功非常關鍵。在這個環節中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4°完成外，最為關鍵的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀實驗的樣品一般是原代培養細胞裂解液或者細胞系裂解液。我們以常用的RIPA裂解液為例（主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度下的NaCl,一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等）來說明其各主要成份的用途，進而幫助我們如何針對不同的實驗目的和不同的蛋白質特性來選擇最佳的裂解液。

a. 緩沖液：離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl濃度一般習慣用150 mM,這主要是因為150 mM接近生理濃度，不會破壞蛋白質之間的相互作用。然而細胞內部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能會破壞這個區域的蛋白質相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋白的亞細胞定位而定。

c. 甘油由于其粘性，可以對蛋白質之間的相互作用起到一個很好的保護作用。一般添加10%的甘油有助于穩定蛋白質之間的相互作用。

d. 裂解液中的去垢劑可以裂解細胞質膜，也同時破壞了許多細胞器的膜，從而釋放了其中儲存的許多蛋白酶。

而由于用于免疫沉淀實驗的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環境受到改變后從而恢復了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實驗非常關鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過Protease Cocktail（多種蛋白酶抑制劑混合物）可以抑制蛋白酶。

e. 去垢劑對于免疫沉淀實驗尤其是免疫共沉淀實驗是一個非常關鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個因素來影響免疫沉淀效果：

- 細胞質/器膜的通透性：因為許多目的蛋白都定位在細胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應。

- 膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構象對去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對這類蛋白的免疫沉淀實驗，需要謹慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。

- 蛋白相互作用：不同去垢劑對不同性質的蛋白質的相互作用影響程度不一樣，需要根據具體蛋白的特性進行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應作用于何種蛋白質現在很難精準預測，所以一個更為切實可行的辦法就是通過具體實驗篩選合適的去垢劑種類和濃度。