免疫球蛋白提取技術

隨著免疫學的發展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為必不可少的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數采用二步法以上相結合的方法，特別是以硫酸銨提純為基礎，再經過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。

硫酸銨溶液能使蛋白質膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來（稱為鹽析）。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同，利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提，為了獲得純化的免疫球蛋白成分，必須進一步采用層析的方法進行分離。

免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

動物血清初乳膽汁

硫酸銨NH4OHPBSNaH2PO4NaH2PO42H2OBaCl2HgIKIHClNaOHPBDEAE52葡聚糖凝膠G200無水硫酸鈉硼酸鹽緩沖液

離心機透析袋低溫冰箱電泳槽電泳儀

1.取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（NH₄）₂SO₄飽和溶液10ml，使成20%（NH₄）₂SO₄溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。

2.3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。

3.在上清液中再加（NH₄）₂SO₄飽和溶液30ml，使成50%（NH₄）₂SO₄溶液，充分混合，靜置30min。

4.3000r/min離心20min，棄上清。

5.于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH₄）₂SO₄飽和溶液10ml，使成33%（NH₄）₂SO₄溶液，充分混合后，靜置30min。

6.3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2——3次。

7.10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。

8.除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數次。

以1%BaCl₂檢查透析液中的SO₄^2-或以納氏試劑檢查NH4 （取3——4ml透析液，加試劑1——2滴，出現磚紅色即認為有NH4 存在），直至無SO₄^2-或NH4 出現為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。

9.離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

10.過DEAE——纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。

也可采用SephadexG150或G200柱。

11.蛋白質及其定量鑒定。

12.IgG的純度鑒定，可采用下列方法之一鑒定。

①玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可

加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度（NH4）2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。

②瓊脂雙相雙擴散鑒定

預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉淀線。

③免疫電泳鑒定

孔內加待測樣品，電泳后，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則只出現一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。

④圓盤電泳鑒定

用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則只有一條區帶。

13.IgG的濃縮與保存

①IgG的濃縮

②IgG的保存

一般濃縮至1%以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。

材料準備與試劑配制

1.動物血清

2.硫酸銨飽和溶液

硫酸銨800g~850g

H₂O 1000ml

加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28%NH₄OH調pH至7.0（不調pH值也可以）。

注：硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H₂S，靜置過夜后濾過，加熱蒸發H2S即可。

3.0.01Mol/L pH7.4PBS液

A液：0.10Mol/L NaH₂PO₄液

NaH₂PO₄?；2H₂O 15.60g

加H2O至1000.ml

B液：0.10Mol/L Na₂HPO₄液

Na₂HPO₄?12H₂O  35.80g

加H2O至1 000ml

取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

4.1%BaCl₂溶液

5.納氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加H₂O至500.00ml

溶化后過濾，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。

7.洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。

8.透析袋（或玻璃紙）。

應用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG，不僅操作復雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取IgG時，則往往采取下列的簡易辦法。

1.DEAE-纖維素直接提取法

取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。

①以一定數量的DEAE52放入燒杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PBS緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復一次。

②用布氏漏斗（內放兩層濾紙）過濾。

③以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。

④于4℃中放置1h，中間攪拌數次。

⑤用布氏漏斗抽濾，再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。

2.DEAE——SephadexA——50為弱堿性陰離子交換劑，經NaOH將Cl-型轉變為OH-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ——G屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時，酸性蛋白均被DEAE——SephadexA——50吸附，只有γ——G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ——G。這種提取法流程大大縮短，純化前后樣品體積變化不大，而且所得γ——G無變性現象。經過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。

①DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE——SephadexA——50若干克，懸浮于蒸餾水中，1h后傾去上層小顆粒，然后用0.50Mol/L NaOH處理1h，蒸餾水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。

②取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液體體積1/4的濾干的DEAE——SephadexA——50，混合、4℃放置1h，不時攪拌、抽濾、收集濾液。

③再用同樣重量的DEAE——SephadexA——50處理濾液。反復處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為γ——G制品。

④DEAE——SephadexA——50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。