免疫球蛋白純化技術——SepharoseCL4B親和柱層析純化IgG

SPA-Sepharose CL-4B

磷酸緩沖液NaN3枸椽酸緩沖液Tris溶液再生緩沖液

玻璃柱

1.  用0.1 M PH8.0 磷酸緩沖液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝膠，15 min。按1 g干膠200 ml上述緩沖液充分洗滌凝膠（用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌）

2.  裝柱后用0.1 M PH8.0磷酸緩沖液平衡

3.  標本可用硫酸銨粗提物，先10000 g離心除去雜質，必要時用0.22 μm濾膜過濾。上樣前用1 M PH9.0 Tris液調整標本液PH至8.1或對平衡液透析過夜

4.  加樣，一般按25～30 mgIgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15 min,0.1 M PH8.0磷酸緩沖液充分淋洗至淋洗液OD值為<0.02

5.  用不同PH的枸椽酸洗脫液洗脫，流速20 ml/h。如純化小鼠IgG1一般用PH6.0；純化IgG2a用PH4.0；純化IgG2b用0.1 M PH3.0醋酸鹽緩沖液或0.1 M PH3.0 Glycine-HCl緩沖液洗脫

6.  用PH3.0或4.0洗脫液洗脫時，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液

7.  收集洗脫液測OD值，根據實驗需要透析除鹽后進行濃度、純度和活性測定

1.　SPA-Sepharose CL-4B凝膠價格昂貴，可再生后反復使用10～20次左右。

方法：先用10倍柱體積0.1 M PH8.5 Tris含0.5 M NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1 MPH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5 M NaCl液洗脫柱上殘存的雜蛋白；0.1 M PH8.0磷酸緩沖液平衡，4 ℃貯存。

2.  SPA-Sepharose CL-4B親和層析法還可用于

（1）除去抗體液中IgG，檢測非IgG抗體（如IgM）的生物學活性；

（2）除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；

（3）回收或純化免疫復合物。
 

3.  狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結合的能力。