免疫球蛋白純化技術—DEAESephadexA50柱層析純化免疫球蛋白

γ球蛋白

NaOHHClNaClNaN3DEAE-Sephadex A-50PEGPB

層析玻璃柱滴定鐵架自由夾螺旋夾尼龍紗冰箱紫外分光光度計電導儀抽濾裝置PH計透析袋座標紙濾紙PH試紙量筒燒杯試管吸管滴管滅菌小瓶

1.  稱DEAE-Sephadex A-50（下稱A-50）5 克，懸于500 ml蒸餾水，1 小時后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5 N NaOH 15 ml的比例，將A-50浸泡于0.5 N NaOH中，攪勻，靜置30 分鐘，裝入布氏漏斗（墊有2 層濾紙）中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5 N HCl同上操作過程處理，最后以0.5 N NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1 M，PH 7.4 PB中過夜。

2.  裝柱
 

（1）將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。

（2）將0.1 M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3 cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流速1 ml/分鐘，同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。

（3）關閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

3.  平衡

啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14 滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關閉出水口，停止平衡。

4.  加樣及洗脫
 

啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品（體積應<床體積的2 ％，蛋白濃度以<100 mg為宜）。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3 次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12～14 滴／分鐘。

5.  收集

開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5 ml。共收集10～15 管。

6.  測蛋白

以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280 nm，與OD260 nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以OD280 nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。

7.  合并、濃縮

將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG（MW6000）洗縮至所需體積，加入0.02 ％NaN₃防腐劑，于4 ℃保存備用。

8.  A-50凝膠的再生

在柱上先以2 M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280 nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4 ℃保存；近期不用時，以無水酒精洗2次，再置50 ℃溫箱烘干，裝瓶內保存。

1.  柱的選擇

從理論上說，只要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。

2.  純化過程必須嚴格控制脫緩沖液的PH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進行柱層析。

3.  所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。

4.  洗脫過程中應嚴格控制流速，且勿過快。

5.  上樣的體積要小，濃度不宜過高。

6.  加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱面變干。