免疫電鏡技術與光鏡免疫細胞化學染色方法的基本原理和試劑準備基本相同,相關內容可參考本書第四章,這里僅介紹免疫電鏡的幾種染色方法,包括包埋前染色、包埋后染色和冰凍超薄切片免疫染色三種。
1.包埋前染色
包埋前染色即在進行常規電鏡包埋處理前先行免疫組織化學染色,然后于解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出,修成2~4mm3大小的組織塊,再按常規電鏡方法處理,包括戊二醛的再固定、鋨酸后固定、脫水、包埋、超薄切片和電鏡觀察等。如果特三性免疫反應的范圍太小或只觀察特定部位的免疫反應,為了準確定位,可做第二次包埋,引第一次包埋時將已進行免疫反應的組織經戊二醛再固定、鋨酸后固定、脫水及包埋劑浸透三置于兩層耐高溫的透明塑料薄膜之間(類似夾心面包),高溫聚合后。在解剖顯微鏡下取出需要的陽性部位作第二次包埋,或將取出的陽性部位用強力快干膠粘在已聚合的包埋劑塊上供切片觀察。
包埋前染色的組織,以中間部位的結構較理想,表層因受機械修整、擠壓的影響,超微結構保存往往不甚理想。為提高工作效率,進行超薄切片制作前,亦應先制作半薄切片觀察。為避免超薄切片電子染色所用的鉛或鈾與免疫染色的結果混淆,應將相鄰的超薄切片分別撈在兩個銅網上,一張直接進行觀察,另一張電子染色后觀察,對比分析。
包埋前染色法的主要優點:①因組織細胞免疫染色前未經OsO4固定、脫水及樹脂包埋等處理,故組織細胞的抗原性保存相對較好,可獲得較好的免疫染色效果;②可在光鏡下選取免疫反應陽性部位定位制作超薄切片,有利于提高電鏡的工作效率。主要缺點是受到抗體穿透性的限制,組織深層細胞內抗原難以標記。
2.包埋后染色
包埋后染色即組織標本經OsO4固定、脫水、樹脂包埋及超薄切片后再行免疫組織化學染色。值得注意的是,在包埋后染色標本制備時,OsO4固定可以省略或盡量縮短后固定時間,因為不少實驗表明,OsO4可使組織細胞的抗原性明顯減弱。包埋后染色是將超薄切片貼在載網上進行免疫染色,染色過程中應注意保持載網濕潤,避免干燥。
包埋后染色具有超微結構保存好、方法簡便、陽性結果可重復性好以及可信度高等優點,可對同一組織塊的連續切片進行其他抗原的免疫標記,能更準確地解釋免疫標記結果,而且還能在同一切片上進行雙重或多重標記。該方法也具有明顯的缺點,如抗原活性可因標本處理過程而減弱或消失。組織中的抗原可與包埋劑發生反應而改變性質,以及被包埋在包埋劑中的組織不易進行免疫反應等。據報道,應用無水乙醇或NaOH飽和溶液等處理超薄切片,可減少或除去組織細胞內的包埋劑,獲得較好的染色效果。
3.冰凍超薄切片染色
將新鮮組織或輕度固定的組織置于2.3mol/L蔗糖液3~5小時,液氮速凍,利用冰凍超薄切片機在冰凍狀態下制作超薄切片,厚度70~l00nm。冰凍超薄切片未經固定、脫水和包埋等處理而直接進行免疫染色,組織細胞的抗原性保存較好,兼有包埋前和包埋后染色的優點。但冰凍超薄切片制作難度大.要求技術熟練程度高,而且,需要特殊的儀器,難以普及推廣。