免疫組化具體操作步驟

  免疫組化是應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術（immunohistochemistry）或免疫細胞化學技術（immunocytochemistry）。

    一、免疫組化操作

    1、石蠟切片脫蠟至水。

    2、3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。

    3、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 【如需抗原修復，可在此步后進行，

    抗原熱修復

    （1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

    （2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

    （3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

    4、5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

    5、PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

    6、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

    7、PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。

    8、滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素（通過化學發光反應發出的光在特定儀器上進行測定）工作液，37℃孵育10-30分鐘。

    9、PBS 沖洗，5 分鐘x3 次。

    10、顯色劑顯色 3-15 分鐘（DAB或NBT/BCIP ）

    11、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

    二、免疫組化（ LP 法）操作步驟

    1. 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步后進行

    2. 緩沖液洗 3min/2 次。

    3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

    4. 緩沖液洗 5min/2 次。

    5. 滴加 Ultra V Block , 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

    （注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

    6. 緩沖液洗 5min/2 次。

    7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）

    8. 緩沖液洗 5min/2 次。

    9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增強子 ） , 在室溫下孵育 20 分鐘。

    10 .緩沖液洗 5min/2 次。

    11 .滴加 HRP Polymer（ 酶標二抗 ） ,在室溫下孵育 30 分鐘。

    （注： HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。）

    12 .緩沖液洗 5min/2 次。

    13 .向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻后滴加到切片上，孵育 3 - 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）

    14 .自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。