免疫組化的實驗試劑及實驗步驟

一、試劑

（1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

（2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。

（3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。

（4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。

（5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

（6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

（7）封裱劑：

a 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；

b 油和TBS(或PBS)配制。

（8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合于光學顯微鏡標本。

二、操作流程

（1）脫蠟和水化

脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；

2)無水乙醇中浸泡5分鐘；

3)95%乙醇中浸泡5分鐘；

4)70%乙醇中浸泡5分鐘；

（2）抗原修復

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

1)抗原熱修復

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

2)煮沸熱修復

電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

3)微波熱修復

在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

4)酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

（3）免疫組織化學染色

SABC法

1)脫蠟、水化。

2)PBS洗兩次各5分鐘。

3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。

4) 抗原修復。

5) PBS洗5分鐘。

6) 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。

7) 滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復溫45分鐘）。

8) PBS洗三次每次2分鐘。

9) 滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。

10)PBC洗3次每次2分鐘。

11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。

12)PBS洗4次每次5分鐘。

13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。

15)脫水、透明、封片、鏡檢。

SP法

1)脫蠟、水化；

2) PBS洗2～3次各5分鐘；

3)3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘

4)PBS洗2～3次各5分鐘；

5)抗原修復；

6)PBS洗2～3次各5分鐘；

7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

8)滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。

9)4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。

10)PBS洗3次各5分鐘；

11)滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；

12)抗中可加入0.05%的tween-20；

13)BS洗3次各5分鐘；

14)DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；

15)PBS或自來水沖洗10分鐘；

16)蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；

17)自來水沖洗10～15分鐘；

18)脫水、透明、封片、鏡檢。