免疫組化技術典型實驗案例學習3

6、以上原因，都是針對實際中常見原因來進行分析的，前提是排除操作者的操作錯誤而引起陰性結果，這就需要新手還是要設置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的PH值過低等其它原因的干擾。

總之，要想把免疫組化做好，可能每一個環節都很重要，但也存在主次之分，出現問題了，需要通過先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對免疫組化原理掌握與否的關鍵所在。

案例三：石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結果或非特異性結果

背景：因實驗需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1（一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白）免疫熒光染色，以前我對酶免疫組化非常熟悉，在園子內也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一直還沒做過（原理知道，但細節不太了解）。我先用石蠟切片做了5次，結果一直不理想（表現為未見特異性強染色）；近幾日，我又切了冰凍切片，做了2次，終于基本成功了。在這個過程中，我對免疫熒光染色技術有了全新的認識，而前些天發出免疫熒光求助貼，回復的很少，所以有必要加強對免疫熒光方面的討論），不妥之處敬請指正。有人會問酶免疫組化做的好好的，為何要做免疫熒光？其實，這也是我以前思考的難題，現在我認為可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫組化可能做不出來，需要敏感的免疫熒光方法來進行蛋白檢測（我是看許多外文文獻都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。）

問題及其解答：如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色？

1、非特異性染色產生原因及其解決方案：

（1）游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置時用透析法或層析法分離熒光素標記的二抗和游離的二抗。購買高質量、高純度的熒光素二抗。

（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。

（3）組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。延長血清封閉時間。

（4）從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。

（6）熒光素不純、標本固定不當等。

（7）一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調整一抗和二抗孵育條件和濃度至最佳。

（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數和延長清洗時間。

2、陰性染色產生的原因有：

（1）一抗和二抗濃度不合適或孵育條件不妥。

（2）熒光素提前衰退。熒光素質量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項。

（3）血清封閉時間過長。

（4）抗體稀釋液PH值不合適，影響抗原抗體反應。

（5）組織切片不平、裂片或脫片很嚴重，易引起大塊陰性著色。

（6）組織標本不新鮮或已經冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來表達的部位陰性染色或弱著色。

（7）熒光顯微鏡不會使用，激發波長選擇錯誤。