免疫組化技術要點

1. 固定

最好用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。

（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。

（2）PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。

2. 組織脫水、透明

時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。

3. 切片時展片

有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。

4. 烤片

60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。

5. 蠟塊及切片的保存

最好在4℃保存

6. 脫片問題

Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進行下一步。

7. 滅活內源性酶

（1）HRP系統：3%雙氧水滅活

（2）AP系統：3%HAc滅活。

8. 暴露抗原

對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9. 封閉

在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉

10. 抗體稀釋

應遵循“現用現配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用。

11. 背景高

在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。

12. 返藍

在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。

13. 顯色

一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

14. 在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。

15. 拍照

免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應盡可能呈現純白色。測量其灰度應在250左右。如果呈現淡藍色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍。