免疫組織化學法實驗——單層生長細胞的免疫熒光標記

在3?5 cm培養皿上生長的單層細胞（培養皿越小所需的抗體就越少 但培養皿應適合顯微鏡下觀察）

VPBS40℃2% (m V)高聚甲醛（PFA)固定液 4℃ 用于細胞表面抗原固定100%甲醇 -10?-20℃ (置于冰箱的結凍室冷卻較為理想）；或含0.1% (V V) Triton×-100的2% PFA固定液 4℃用于細胞質抗原固定第一抗體 約5?10μg mL第二抗體：抗特定種屬來源的第一抗體的抗體熒光染料結合物

培養皿

1) 細胞置于冰上冷卻，吸去培養液并以4℃的PBS洗滌，吸去PBS。

2) 如欲研究細胞表面抗原，則以2% PFA于冰上固定30 min。如研究細胞質抗原，則 可用含0.1% Triton×-100的2% PFA于冰上固定30 min,或以100%甲醇在普通冰箱的結凍室（-10?-20℃)固定15 min。

兩種固定細胞質抗原的方法均可獲滿意結果。然而，用高聚甲醛/Triton×-100固定通常可獲更佳 的形態學觀察結果，如采用甲醇固定法，應確保細胞在放入冰箱以前，先用甲醇充分予以洗滌，否則細胞會凍結。使用與泵連接的巴斯德吸管抽吸液體。

3) 吸去固定液，用4℃的PBS洗2次（5 min/次)。稀釋的第一抗體于4℃用微量離心機以13 500 g離心2 min。

4) 加第一抗體于培養皿中，使其恰好覆蓋細胞，4℃溫育1 h。然后用4℃的PBS洗4次 (5 min/次)。

5) 稀釋的第二抗體在4℃用微量離心機以13500 g離心2 min。

6) 加入第二抗體，4℃溫育1 h。然后用4℃的PBS洗4次。

7) 若不想立即觀察細胞，則將細胞于PBS中存放。蓋好培養皿，以鋁箔包裹，冷藏。 在24 h內觀察此實驗結果是很重要的，因熒光會迅速減弱或與細胞解離。

如用LabTek細胞培養玻片，可取玻片以Gelvatol進行封片處理。