免疫組織化學（HRPDAB系統）

1. 溶液準備：

PBS （ pH7.4 ） :10mM Na2HPO4 ，1.8mM KH2PO4 ， 50mM NaCl ， 2.7mM KCl

封閉緩沖液：3%BSA-PBS

2. 程序：

1 ） 對石蠟切片進行脫蠟和水化：3×10min 二甲苯，5min 100%乙醇，5min 95%乙醇，5min 80%乙醇， 5min 70%乙醇，3×5min PBS。

2 ） 修復抗原，PBS洗滌三次，每次5min。

3 ） 室溫下，將玻片在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡15min封閉內源性過氧化物酶，然后用PBS洗滌三次，每次 5min。

4 ） 加入一抗（用3%BSA-PBS封閉液1:50稀釋一抗），37℃濕盒孵育1h。

5 ） 加入Post-blocking室溫濕盒孵育30min,然后用PBS洗滌三次，每次5min。

6 ） 加入稀釋好的辣根過氧化物酶（HRP）標二抗，室溫下濕盒孵育30min。

7 ） 用PBS洗滌玻片5次，每次5min。

8 ） 按照DAB試劑盒說明添加顯色液，避光顯色30s-5min。用蒸餾水終止顯色反應。

9 ） 蘇木精進行復染色3min,用蒸餾水沖洗。

10 ） 立即進行脫水和透明：1×5min 70%乙醇，1×5min 80%乙醇，1×5min 90%乙醇，1×5min100%乙醇，2×10min二甲苯。

11 ） 中性樹膠封片。

3. 抗原修復方法：

① 檸檬酸鈉法：

（a） 把玻片放在玻璃固定架上，再將架子放在盛有600ml的10mM檸檬酸鈉（pH6.0）的容器中。

（b） 微波中高火6-8min。

（c） 室溫冷卻。

（d） 用PBS洗滌3次，每次5min。

② 蛋白酶K法：

（a） 配制新鮮溶液：

25μl 20mg/ml蛋白酶K

2.5ml 1MTris-HCl（pH8.0）

0.5ml 0.5M EDTA（pH8.0） 加水定容到50ml

（b） 37℃下，將玻片放在架子上孵育5min（蛋白酶K不要預熱）。

（c） 用PBS洗滌3次，每次5min.

③ 尿素法：

（a） 把玻片放在玻璃固定架上，再將架子放在盛有600ml 的1M尿素（新鮮配制）的容器中。

（b） 微波10min,20min或者30min,每5min補充一次蒸發掉的水。

（c） 冷卻30min到1h。

（d） 用蒸餾水洗滌4次，每次3min,再用PBS洗滌3min。