免疫組織／細胞化學染色2

四 結果分析

染色結果的判斷除了上述之外，還可以從以下方面加以判斷：

（1） 陽性反應與非特異性著色區別：陽性反應分布總是有規律性的，局限定位某一部位而非特異性著色則無規律性，無界限，定位不準確，且不能重復，結締組織受染和內源性產物干擾是最多見的非特異性著色。
（2） 人為造成非特異性反應如切片折疊，刀痕，以及組織處理過程中出現的色素，沉淀物以及組織細胞壞死等都可以出現非特異性反應。
（3） 有的抗原被吞噬細胞吞噬，或停留某一部位，這些都影響抗原的正確定位。
（4） 如陽性對照和待檢片都呈陰性反應，檢查操作中是否顛倒了抗體順序或漏加某一抗體；組織在處理中抗原被破壞；某一抗體失效；顯色試劑如DAB配制時漏加H2O2等。
（5） 陽性和待測片均呈弱陽性，抗體稀釋度過大；切片殘留緩沖液過多；孵育時間過短，抗體放置過久效價下降等。
（6） 所有切片過度著色，多見于顯色液中H2O2過多，顯色過長，切片粘合劑使用不當，切片過厚，抗體稀釋不夠，或沒有用非免疫血清處理切片等。

五 常用液體的配制：
10.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS） PH7.2
NaH2PO4 儲備液（A） 19ml
NaHPO4 儲備液（B） 81ml
Nacl 17g
加雙蒸水至 2000ml
注：A液 0.02M NaH2PO4.2H2O 31.2g 加蒸餾水1000ml
B液 0.02M NaHPO4.2H2O71.6g加蒸餾水1000ml
20.05mol/L TBSPH7.6
0.2mol/LTris 250ml
0.1mol/L Hcl 400ml
Nacl 8.5g
蒸餾水加至 1000ml
2 0.05mol/L枸櫞酸緩沖液 PH5.5-6.0
醋酸胺儲備液 99.0ml
枸櫞酸儲備液 1.0ml
注：儲備液配制： 醋酸胺1.93g 加蒸餾水500ml
枸櫞酸1.05g 加蒸餾水100ml
3 3,3′--二氨基聯苯胺（DAB）顯色液
DAB 5mg
0.05mol/L PH 7.6 TBS 10ml
30% H2O2 μl5
將5mgDAB溶解于10ml0.05mol/L PH 7.6 TBS中，充分攪拌，使之溶解后，用雙層濾紙過濾，用前加 30% H2O2 5μl。顯色陽性結果為棕褐色。
4 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）顯色液
AEC 4mg
二甲酰胺（DMF） 1ml
0.05mol/L PH5.2 醋酸緩沖液14ml
30% H2O2 μl15
先將AEC溶解于DMF中，再加入醋酸緩沖液，充分 混勻，用前加30% H2O2。顯色陽性結果為紅色。
5 3%過氧化氫（H2O2）
90ml的蒸餾水或甲醇中加入10ml的30% H2O2 即可。用于封閉內源性過氧化物酶。
6 0.4%胃蛋白酶（Pepsin）
胃蛋白酶400mg溶于100ml的0.1NHCL中即可。消化時間37℃、10-30min。主要用于細胞間質抗原的免疫組化。
7 0.1%胰蛋白酶（Trypsine）
胰蛋白酶 0.1g
0.1%氯化鈣100ml
濃Hcl 7ml
首先配制0.1%的CaCl2, 用0.01mol/L的NaOH將其PH值調至7.8，然后加入胰蛋白酶溶解，必要時可過濾。消化時間37℃、5-30min。主要用于細胞內抗原的暴露。