免疫細胞的分離和保存技術

概述
臨床上的各種類型的免疫缺陷、自身免疫病以及腫瘤等疾病均可出現淋巴細胞或淋巴亞群的數量和功能的變化。因此用體外方法對機體具有免疫反應的外周血淋巴細胞及其亞群的數目或比例以及它們所顯示的功能的強弱進行檢測，是判斷機體細胞免疫水平的一種重要手段。這對于臨床認識疾病、探討其發病機制、觀察病情變化、判斷預后、考核療效和防治疾病等方面均有重要意義。

第一節 免疫細胞的分離
用體外方法對機體各種具有免疫反應的細胞分別作鑒定、計數和功能測定，是觀察機體免疫狀態的一種重要手段。為此，須將各種參與免疫反應的細胞從血液中分離出來。參與免疫的細胞主要包括：淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等。

一、白細胞的分離
血液中紅細胞與白細胞比例約為 600~1000：1，兩者的比重不同其沉降速度也不同，通常用兩種方法加以分離。
1、自然沉降法 外周血， 抗凝，靜置約一小時血液分為三層，上層為血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為WBC，輕輕吸取此層即可得到富含WBC懸液，低滲破壞RBC，洗滌即可。
2、聚合物加速沉淀法
常利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐等，將紅細胞快速沉降，從而分離出白細胞。本法的細胞獲得率比自然沉降法高。

二、外周血單個核細胞的分離
人血液中各種細胞的密度如下：
紅細胞：1.093
白細胞：1.092
淋巴細胞和單核細胞：1.075~1.090
血小板：1.030~1.035
單個核細胞包括：淋巴細胞和單核細胞。
分離血細胞常用的分離劑為：Ficoll和Percoll分離劑
1、 Ficoll分層液
主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次密度梯度離心分離法。其主要成分為聚蔗糖(商品名為Ficoll )其密度為1.020。可將血液分成四層，從上到下依次是：血漿、單個核細胞、粒細胞和紅細胞。
2、 Percoll分層液
是一種連續密度梯度離心分離法，其主要成分為：硅膠顆粒，其原液密度為：1.135。可將血液分成四層，從上到下依次是：死亡細胞和血小板、單核細胞、淋巴細胞、粒細胞和紅細胞。
第二節 淋巴細胞及其亞群的分離
1、純淋巴細胞群的采集
原理：利用單核細胞在37℃和Ca離子存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據此建立許多從單個核細胞中除去單核細胞的方法，以獲得高純度的淋巴細胞群。
(1)粘附貼壁法
因B細胞也有貼壁現象，因此，本法分離的淋巴細胞群中B細胞有所損失。
(2) 吸附柱過濾法
將單核 細胞吸附于玻璃柱中，洗脫下來的主要是淋巴細胞
(3)磁鐵吸引法
利用單核細胞具有吞噬的特性，在懸液中加入羰基鐵顆粒，待單核細胞吞噬鐵顆粒后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細胞群。

(1)E 花環沉淀法
方法：淋巴細胞+SRBC懸液→加入分層液→T細胞形成E花環而沉于管底→懸液中為B細胞。
（2）尼龍毛分離法
方法：淋巴細胞→通過聚酰胺纖維管→洗脫下來的是T細胞
（3）親合板結合分離法—分離亞群
方法：將所需的細胞對應的單克隆抗體包被于小管內→加入淋巴細胞→形成Ag-Ab復合物→洗去不反應的物質。
（4）熒光激活細胞分離儀法
熒光激活細胞分離儀(FACS)主要由4部分組成:細胞流動系統及氣壓流速控制系統;激發系統;檢測與訊號處理系統;細胞分選系統。
其原理是：細胞經熒光染色后，通過高速流動系統，細胞排成單行，逐個流經檢測區進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個/s)，每小滴內最多含一個細胞，細胞經激光束照射產生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉換成脈沖信號，數據經電腦處理，分辨細胞的類型。
（5）磁性微球分離法
磁性微球是將磁性材料顆粒表面進行外理，微球的核心為小金屬顆粒，核心處包裹高分子材料（聚苯乙烯），可結合不同的生物大分子物質（抗原、抗體、核酸等），若微球表面包被有免疫物質者稱為免疫磁珠，其兼有免疫配基的性質和磁響應性質，即在磁場中顯示磁性，移出磁場時磁性消除。目前商品出售的磁珠有直徑為1~5um等不同的規格，表面活性基團有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羥基（－OH）等，包被的免疫物質有：一抗、二抗等。
方法：將包被有關抗體的磁珠與待分離細胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應的細胞結合成：細胞－抗體－磁珠復合物，該細胞在磁場中運動與其他細胞產生明顯差別。如采用層析的方法，將層析柱放于強磁場中，與磁珠結合的細胞運動將受限，而未與磁珠結合的細胞將先被洗脫下出來，再將該柱移出磁場，與結合的細胞也將被洗脫下來，達到分離目的。
第三節 吞噬細胞的分離和收集
一、Percoll分離法 此法從外周血中分離出單核-巨噬細胞，但由于此類細胞在外周血中的含量較低，分離時所需的血量較多。
二、斑螯敷法 此法可從人體組織液中獲取較純的吞噬細胞。其方法是：用濾紙蘸取10%中藥斑螯酒精浸出液，貼敷在臂內側皮膚表面，4~5小時后皮膚局部充血，48小時后局部形成水泡，吸取水泡中的組織液，內含大量巨噬細胞。但此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染。
第四節 淋巴細胞的保存和活力測定
1、分離細胞的保存
（1）短期保存
用含有10%~20%滅活小牛血清的 Hanks、Tc-199、 RPMI 1640培養液可保存數周
（2）長期保存及復蘇
保存：在保護劑二甲亞砜中于液氮（-196℃)中保存。其過程是：先對需凍存的細胞作活細胞計數，低速離心后，取沉積細胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當濃度的細胞懸 液，分裝于凍存管內，立即放入降溫過渡站( -80℃)中，繼而進行降溫(-196℃)冷凍。
復蘇：將其從液氮中取出，立即放入40 ℃溫水中，融化后加入10倍的培養液混勻，低速離心，洗去保護劑，再懸于新培養液中，計數并檢查細胞活力。
2、細胞活力的檢測
常用方法是臺盼藍染色法。這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞而使細胞著色（藍色）。