一、材料和試劑
1、玻片：須用免疫組化專用玻片，或用2%多聚賴氨酸包被處理玻片。
2、5-10%正常山羊血清封閉液，用PBS配。
3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。
4、0.01M PH7.4 PBS
5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）
6、AEC底物
（1）底物緩沖液（20X） PH 4.6
醋酸（分子量60.6） 30.6ml
Triton -100
醋酸鈉 3H2O（分子量136.1）66.68克
加蒸餾水到960ml，調PH到4.6，最后加蒸餾水到總體積1000ml
（2）AEC（20X）
AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中）
（3）0.6% H2O2（20X）
臨用時，（1）（2）（3）各50ul，在1ml雙蒸餾水中混勻30分鐘內有效。
7、DAB（即DAB-4HCL）
（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）
（2）1M Tris（20X），用HCL調PH到7.4
（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鮮配，避光，30分鐘內有效。
溶解后（可加熱到500C），加水合氯醛 50克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4），枸櫞酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室溫或40C保存。
8、蘇木素復染液
蘇木素 1克
碘酸鈉 0.2克
鉀礬 50克
水 1000ml
9、含10%及2%小牛血清的DMEM培養液。
10、3%H2O2：30% H2O2 1份，加9份雙蒸水，臨用時配。
11、細胞抗原玻片及96孔細胞抗原板（見ICC protocol 04）
12、封片液：1克明膠，溶于30ml 350C水中，加入35ml 甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。
二、細胞內源過氧化物酶阻斷（使用HRP標記二抗或SP法時必須阻斷）
1、從冰箱取出細胞片或細胞板，置室溫或370C 10-15分鐘，使恢復溫度。
2、加3%H2O2，細胞片20ul/孔，培養板100ul/孔，使充分覆蓋住細胞。
3、室溫10分鐘后，甩掉H2O2，用PBS輕輕淋洗2分鐘。用濾紙吸干細胞周圍水份，96孔在濾水紙上扣干，但注意保持細胞濕潤。
三、封閉
細胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），細胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分鐘后甩掉封閉液，不洗。
四、免疫化學染色
1、分別加一抗和所有對照一抗，細胞法10-20ul/孔，細胞板50ul/孔，使充分覆蓋細胞。37℃1小時或4℃冰箱過夜；
2、棄去一抗，如為細胞涂片用PBST輕輕簡單淋洗1次后，浸于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速搖床上）3-5分鐘，轉入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗3-5分鐘。擦干細胞片周圍水分，96孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3-5分鐘后倒掉，在濾紙上扣干，但保持細胞濕潤，反復3-4次；
3、加S.P試劑（S.P法，即放大法）
（1）加已優選好的濃度的Biotin標記二抗，細胞片10ul/孔，細胞板50ul/孔，使充分復蓋細胞。37℃溫和孵育30分鐘；
（2）按免疫化學染色“2”所述方法洗滌和擦干；
（3）加已優選好濃度的S.P試劑，用量同“（1）”，37℃孵育30分鐘后按免疫化學染色“2”法洗滌及擦干；
4、間接法加二抗（不放大法）
方法同S.P法，但不用Biotin標記二抗，而改用HRP直接標記二抗。并省略（3）步驟；
5、加底物顯色
（1）、加足量的AEC顯色液，充分覆蓋細胞層，細胞玻片20ul/孔，細胞培養板50ul/孔，置于37℃恒溫箱孵育5-10分鐘，一般在顯微鏡下根據結果顏色的呈現情況掌握染色時間，以得到滿意的結果（陽性對照顯色程度為“+++” ），用自來水即可終止反應；
（2）、復染：蘇木素染液（使用時間最好不超過兩個月）加蘇木素復染液1-2滴，1分鐘左右，在自來水龍頭下輕輕沖洗掉蘇木素，再浸于PBS中約30秒鐘返藍色，最后在蒸餾水中漂洗。
6、封片
洗后細胞片擦去周圍水分，滴加1滴甘油—明膠封片液，加蓋玻片，除去氣泡，用指甲油或樹膠封固玻片。
五、結果判斷
KSHV 陽性——誘導后BCBL-1細胞有10%-30%顯紅色，強度不一，未誘導BCBL-1陽性細胞（1-30%）
陰性——誘導和未誘導BCBL-1細胞完全不顯色（排除邊緣效應）
MCMV/HVMV 陽性——感染病毒的細胞有病灶反應，顯紅色，強度不一，未感染細胞不顯紅色（排除非特異性染色）
陰性——感染細胞和未感染細胞不顯紅色
注意：
1、一抗、二抗的稀釋采用1%BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀釋采用PBS
2、整個反應過程在濕盒中進行（細胞片）
3、洗滌時應使用染色缸（細胞片）
六、說明
1、測血時一抗血清稀釋度要求
項目 KSHV MVMV HCMV 其它
稀釋度 1:50，1:100,1:200 1:50，1:100,1:200 1:100，1:500,1:1000 1:100，1:500,1:1000
可融合標準 1:100陽性時 1：100陽性 1：500陽性 1：500陽性
2、S.P法使用二抗的不同情況
項目 MCMV HCMV 其它
樣品 母克隆、亞克隆細胞培養上清 血清、母克隆、亞克隆細胞培養上清 血清、母克隆、亞克隆細胞培養上清
一抗為IgG型，
Biotin標記二抗 Biotin-Anti mouse IgG F(ab`)2,SIGMA,CAT:B6774
一抗為IgM型，
Biotin標記二抗 Biotin-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT:62-6440
稀釋度 1：200
3、間接法（不放大法）使用二抗的不同情況
項目 MCMV KSHV
樣品 血清 血清、母克隆、亞克隆細胞培養上清
一抗為IgG型，
HRP標記二抗 HRP-Anti mouse IgG Fc,1:100,SIGMA,CAT:A-0168
一抗為IgM型，
HRP標記二抗 HRP-Anti mouse POLYVALENT,1:100,SIGMA,CAT:A-0412
稀釋度 1：100
4、對照系統，必須要做的對照系統如下：
陽性對照：標準一抗，陽性血清，陽性上清
陰性對照：
（1）陰性一抗對照：小鼠免疫前血清、測上清時用原克隆上清液
（2）陰性抗原細胞對照：未感染病毒的細胞，每個待測及對照均須做陰性細胞對照
空白對照：不加一抗，用1%BSA替代
無關對照：與本項目無的第一抗體