1蛋白質的處理:由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質的吸附,并可使溶膠聚沉,故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意,蛋白質溶液應絕對澄清無細小微粒,否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在,因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質的吸附。
2蛋白質最適用量的選擇:將待標記的蛋白質儲存液作系列稀釋后,分別取0.1mL(含蛋白質5～40μg)加到1mL膠體金溶液中,另設一管不加蛋白質的對照管,5min后加入0.1mL10%NaCl溶液,混勻后靜置2h,不穩定的金溶膠將發生聚沉,能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10%即為最佳標記蛋白量。
見標記步驟:在接近并略高于蛋白質等電點的條件下標記是比較合適的,在此情況下蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。
1）用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl調節金溶膠至所需pH(標記SPA時調到pH6.0)。
2）于100mL金溶膠中加入最佳標記量的蛋白質溶液(體積為2～3mL),攪拌2～3min。
3）加入5mL1%PEG20000溶液。于10000～100000g離心30～60min,小心吸去上清液。
4）將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/mLPEG20000的緩沖液中,離心沉淀后,再用同一緩沖液恢復,濃度以Alcm/540nm=1.5左右為宜,以0.5mg/mL疊氮鈉防腐,置4保存。
5）包被后的金溶膠也可濃縮后于SephadexG-200柱進行凝膠層析分離純化,以含0.1%BSA的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2,以A蛋白包被的金溶膠洗膠液pH為7.0。
以上操作中應注意,一切溶液中不應含雜質微粒,可用高速離心或微孔濾膜預處理。