思考題
1. 酶聯免疫吸附實驗的基本原理是什么？常用方法有那些？
2. 間接法和直接法相比各有什么優缺點？
放射免疫測定法—— 125 I 標記技術
放射免疫測定 (radioimmunoassay, RIA)
是將同位分析的高靈敏度與抗原抗體反應的特異性相結合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法。由于此項技術具有靈敏度高（可檢測出 ng 至
pg
級的微量物質）、特異性強（可分辨結構類似的抗原）、重復性好、樣品及試劑用量少、測定方法易規范化和自動化等優點，因此在醫學及其他生物科學研究領域和臨床實驗診斷中廣泛的應用于各種微量蛋白質、激素、小分子藥物及腫瘤標志物等的分析與定量測定。
RIA 常用的放射性同位素有 125I、 135I、 3H、14C等，其中以125I最常用。因其具有以下優點 ① 125 I
化學性質活潑，容易標記成功，可以用較簡便的方法標記抗原或抗體； ② 125I
衰變過程中不產生b射線，對標記蛋白、多肽等抗原的免疫活性無顯著影響； ③ 容易獲得高比放性的標記物，測定的靈敏度較高； ④
釋放的g射線可以用晶體閃爍計數儀直接測量，方法簡便，易于推廣應用； ⑤ 125I的核素豐度、計數率及半衰期（125I60 天,135I 8.1
天）均優與135I 。
標記125I的氯胺T法：（標記甲型肝炎病毒抗體—抗 HAV IgG）
實驗原理
氯胺T是氯代酰胺類氧化劑，在水溶液中易分解形成次氯酸，將 125I-氧化成放射性單質碘（125I2），其可取代酉各氨酸殘基苯環上的氫原子，或與組氨酸殘基的咪唑環共價連接，使蛋白質或多肽發生碘化反應。
實驗材料
1. 抗 HAV IgG （約含蛋白 5mg/ml ）
2. Na 125 I ( 比放射性 >20mCi/ml) 1mlCi
3. 0.25M pH7.4 PBS ； 0.05M pH7.4 PBS
4. 氯胺 T 50 m l/100 m l （臨用前用 0.25M PBS 配置）
5. 偏重亞硫酸鈉 100 m g/100 m l （臨用前配置）
6. 1% KI （溶于 0.05M PBS ）
7. Sephadex G25 層析柱（ 1 × 20cm ）：稱 10g Sephadex G25 ，用 0.05M pH7.4 PBS
浸泡，漂洗后裝柱，然后用溶于同種緩沖液的 1% 牛血清白蛋白（ BSA ） 1ml 上柱封閉，以減少標記蛋白通過時的吸附損耗。
8. 小試管 （用于收集洗脫液的試管應先用 1%BSA 濕潤以封閉管壁）
9. 微量進樣器
10. 晶體閃爍計數儀
11.15% 三氯醋酸
實驗方法
1. 取 1 小試管，加入抗 HAV IgG 2.5 m g ， 0.05M PBS 50 m l ， Na 125 I 800 m Ci （具體體積根據 125 I 衰減表查算）。
2. 再加入氯胺 T 30 m g （快速加入，立即震搖），室溫反應 3 分鐘。
3. 加入偏重亞硫酸鈉 60 m g ，終止反應。
4. 加入 1% KI 200 m l （作為載體，用以稀釋放射性碘，減少吸附）。
5. 將上述反應液通過 Sephadex G25 層析柱，待液體進入柱床后，用 0.05M PBS 洗脫，按每管 10 滴 / 分收集，共 45~50 管。
6. 用晶體閃爍計數儀測量各管的放射值，將放射性最強的標記蛋白 3~4 管合并，加 15% 三氯醋酸沉淀蛋白，離心。測定上清和沉淀的 cpm ，求出蛋白沉淀的 cpm 占總 cpm （上清 + 沉淀的 cpm ）的百分率。
7. 計算 125 I 標記蛋白的比放射性：單位重量標記蛋白上的放射性強度稱為重量比放射性。計算公式如下：
125 I 蛋白 ( m Ci/mg)= 所用 125 I 總放射性 ( m Ci)× 125 I 標記率 / 所用蛋白總量 ( m g)
注意事項：由于實驗中使用了放射性同位素，因此實驗過程中所有含 125 I 的液體及試劑均不能隨意棄置，需集中處理。另外注意不要讓其濺入口、眼