1.免疫組織化學染色中的非特異性的問題，是決定結果好壞的關鍵問題，其核心問題是交叉反應。選擇特異性強、親和力高、稀釋度高的第一抗體是避免非特異染色最有效的方法。實驗中常用到的抗體主要是單克隆抗體和多克隆抗體。單抗是針對單一抗原決定簇制備的抗體，具有特異性強、重復性好等優點，但在提純過程中易變性，穩定性差；多抗是將純化的抗原直接免疫動物后，從動物血中獲得的免疫血清，其可以識別多個抗原表位，因此特異性相對較低、易產生抗體的交叉反應、重復性差、每批次都有可能不同。在實際工作中，可根據具體需要以及參考文獻的報道選擇合適的抗體。其他原因及解決辦法如下。
(1)抗原間的交叉反應主要是標本固定不當或組織抗原封閉不全。每個抗原有不同的抗原決定簇，也可能有類似的抗原決定簇。因此可以選擇結構相近的抗原做抗體吸收實驗以避免抗原間的交叉反應。
(2)抗體與抗原除待檢測的抗原外，組織中還可能存在類屬抗原，也可與相應抗體結合。通常用2%-5%牛血清白蛋白或二抗來源的動物血清進行封閉。
(3)第二抗體產生的非特異性主要是非IgG蛋白或非特異的IgG蛋白之間，通過特異性反應或通過非特異的疏水鍵與組織或細胞結合，產生非特異性染色。處理方法同上。
(4)熒光性非特異組織有自發熒光；部分游離熒光素殘留在二抗中，未與抗體蛋白質結合；抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶了過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。解決辦法可以通過對照實驗或PBS代替進行鑒別和排除。注意選擇特異性強、質量好、純度高的熒光二抗。
(5)內源性過氧化物酶若標本因灌流固定不當，可能存在紅細胞和粒細胞中的內源性過氧化物酶。可以通過甲醇-H202處理切片，避免DAB反應形成非特異染色。
2.片子著色不均勻現象，主要是：
（1）石蠟切片染色，脫蠟不充分，可以先在60℃烤箱烤1h;
（2）脫水不徹底，需配置新鮮的梯度酒精；
（3）貼片孵育抗體時抗體覆蓋不均勻，切片傾斜，抗體流失等原因，需平放切片，切片擦干后再加抗體，也可以用免疫組化筆（在載玻片上的有組織的邊緣畫圓，防止抗體外溢），既節約抗體又避免抗體流失；
（4）冰凍切片漂染，每組切片不宜太多，否則互相重疊，導致接觸抗體不均勻。
3.切片染色背景太深，不易區分特異性與非特異性著色。這主要是：
（1）抗體孵育時間過長或抗體濃度過高；
（2）抗體質量差或變質；
（3）DAB濃度過高，顯色時間過長，或反應時溫度過高；
（4）PBS沖洗不充分，殘留抗體增強著色；
（5）切片染色過程中出現干片，而導致非特異性著色增強；
（6）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太久（大于24h),不可室溫長時間放置。
4.石蠟切片抗原修復方法很多，從弱到強有胰酶修復、微波修復、高壓修復。修復液也分若干種，如pH6.0袧橡酸鈉修復液、pH8.0的乙二氨四乙酸二鈉(EDTA)修復液、pH9.0的EDTA-Tris修復液等，修復時間也根據標本、抗原、抗體等選擇。
5.各個步驟之間的漂洗非常重要，可以防止一抗、二抗殘留試劑引起的非特異著色。如果染色抗體種類較多，切片組別較多時不僅漂洗時間要足夠，而且還可以單獨漂洗，防止抗體之間的交叉污染。
來源《組織培養和分子細胞學技術》（北京出版社）
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