四、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。
熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。
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第五節 非特異性染色的消除方法
一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純，標本固定不當等。
二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因采取適當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。
（二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸于大于標記物體積約50～100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章 。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉淀反應），繼續洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之后出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉淀）。最后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4++及NH4+后可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下：
DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。
經過DEAE-纖維素層析后的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。
（七）純化抗體法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反復洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/l pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。
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