免疫酶技術中常用的酶底物系統

各種免疫酶技術,最終都是以某種顯色反應而揭示待測物質來進行定性和定量分析。不同酶要選擇相應的底物,見下表。

免疫酶技術中常用的酶-底物系統

酶結合物催化作用隨時間的延長而增強。但隨著酶催化時間的延長,某些底物會產生自發的變性,使最終顏色反應加深而干擾結果判斷。產物產生的多少(反應產生顏色的深淺)與 H₂O₂ 的用量有很大的關系,故在底物溶液配制時應注意控制 H₂O₂ 的用量。由于這是氧化還原反應,無色供氫體可被空氣中的氧氧化,因此底物溶液必須臨用時配制(可在臨用前加 H₂O₂),以保證新鮮,另外要控制好酶促反應時間,常掌握在20～60min之間。

用 ELISA 法檢測半抗原時,由于它不能被聚苯乙烯反應板吸附,故而不能直接進行檢測。目前最常用的方法是用半抗原載體蛋白結合物的形式包被。例如將半抗原與牛血清蛋白偶聯產物免疫動物制備抗半抗原的抗血清或單克隆抗體,再用半抗原與卵清蛋白偶聯產物進行包被和檢測。但這種方法制備的包被抗原重復性不好,在貯存中不穩定,且易與抗血清發生交叉反應。為了解決半抗原吸附問題,Verschoor 等報道用尼龍(如尼龍-6)作為半抗原的載體,用二環己基碳二亞胺(dicyclorexylcarbo,Dcc)為交聯劑制備半抗原-尼龍結合物。它不僅在室溫放置穩定,且用苯酚乙醇溶解后即可在聚苯乙烯反應板上包被。也有的用戊二醛將含有氨基的半抗原直接與微孔反應板連接。總之,用 ELISA 法測定半抗原是很困難的。

在提高 ELISA 法的靈敏度方面,可采用預先將抗體、酶標抗抗體混合,使之充分結合后,再加入到包被抗原中。也有的采用多種酶的放大系統,如采用形成酶:抗體-抗原-酶:復合物的兩種酶的級聯放大系統,使靈敏度大大提高。

在 ELISA 法檢測中,非特異性反應會有嚴重的干擾作用。在包被液中加入牛血清清蛋白或白明膠,在洗滌液中加入吐溫-20(吐溫-月桂酸)都是為了減少非特異吸附的。目前諸多的檢測試劑盒是用單克隆抗體代替多克隆抗體,這樣可提高免疫反應的特異性,減少非特異反應的干擾。

目前,ELISA 法測定技術與其他技術結合已發展為專門的分析方法,如與電泳技術結合的免疫印染技術,與層析結合的層析-ELISA 技術等。特別是免疫印染技術在生物化學、分子生物學的應用,已相當成熟和廣泛。

 ELISA 法可檢測范圍在 ng 至 pg 水平,屬于超微量分析技術。顯然它對試劑、蒸餾水、微孔板以及實驗各步驟的反應條件和操作都有嚴格要求。但如果實驗結果不理想,也還是要從上述幾方面及抗原抗體比例方面尋找原因。