免疫酶染色試驗——斑點免疫酶染色法

該技術是進行 ELISA 測定時，借用了免疫印跡技術的某些原理和方法，利用硝酸纖維素膜為固相載體，使抗原抗體反應在膜上進行，結合在硝酸纖維素膜上的酶抗體結合物通過將底物分解成不溶性的產物而沉積，在硝酸纖維素膜上形成斑點。待測抗原或抗體含量的高低可通過膜上斑點顏色的深淺來判斷。

輪狀病毒

抗輪狀病毒免疫血清酶標記抗輪狀病毒單克隆抗體或多抗二氨基聯苯胺（取 6 mg DAB 溶于 10 ml 0.05mol L Tris-HCl(pH7.4)中加 30%(ml ml)H202 20μL 用前配制 避光封閉液和稀釋液均為含10 g L 牛血清白蛋白的 0.01mol L PBS洗滌液為含 0.05 % Tween 20 的 0.05mol L Tris-HCl

微孔濾膜：硝酸纖維素濾膜微孔板：可用酶標板或血凝板。

1) 根據微孔板孔的大小，將濾膜切成大小合適的小條，編號。

2) 抗體點膜：用微量注射加樣器取包被抗體加在濾膜一端，每點 2μl, 室溫干燥固定 30 min 。

3) 封閉：用含10 g/L 牛血清白蛋白的 0.Olmol/L PBS (pH 7.4)37℃封閉1h,涼干后置 4℃冰箱備用。

4) 加糞樣：取待測病人糞樣上清 100 μl 加入微孔板孔內，然后插入已包被抗體的濾膜小條，置濕盒 37℃ 45 min。同時設陽性及陰性對照。

5) 洗滌：取出濾膜小條，置平皿中用洗滌液洗 3 次，每次3min 。

6) 加酶標抗體：取 100 μ1 稀釋的酶標抗體加人另一微孔板孔內，插入洗滌后的濾膜小條，置濕盒 37℃ 45 min 。

7) 洗滌：取出濾膜小條，置平皿中用洗滌液洗 3 次，每次3min 。

8) 底物顯色：將洗滌后的濾膜小條浸入新配制的底物溶液中，顯色5min。用蒸熘水洗去底物溶液，終止顯色。

(3) 結果：肉眼觀察，棕色斑點為陽性，未著色斑點為陰性。

良好的病毒抗原片是正確判斷染色結果的基礎，染色過程中每一個步驟或環節都可能影響到染色的最終結果。應注意以下幾點：

1. 標本的固定方式和溫度要正確，同時設立陽性和陰性對照。

2. 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶的抗體，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液，一抗的使用濃度過高會使整個切片全都染上了顏色；檢查底物溶液是否有效。

3. 所有的試劑要按正確的順序加入，不要忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

4. 檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的 pH 值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。

5. 溫育的時間要足夠，溫育時切片要放平，否則會導致抗體流失。

6. 清洗要充分。

操作更為方便、簡單和經濟實用。其與經典 ELISA 檢測的主要區別是：多數采用硝酸纖維膜作為載體，而不是聚苯乙烯微孔反應板；所用酶底物經分解后在局部產生不溶性產物沉淀。