PCR克隆需要提取表達基因的組織或細胞的RNA,反轉錄為cDNA,再從cDNA擴增出目的基因。獲得的目的基因不大容易做序列上的修改,任何突變體都必須通過后續的突變步驟得到。密碼子優化就更不可能了。
PCR克隆的另一個重大局限是對表達豐度低的基因、表達時間極短的基因等特殊基因難以成功克隆。比較而言,全基因合成是一種更加靈活,更容易成功而且價格更便宜的克隆方法。