產志賀毒素大腸桿菌（STEC）是引起人類疾病的重要食源性致病菌之一，該分離菌能引起溶血性尿毒綜合癥（HUS），導致人體腎衰竭。2011年7月，由STEC引發的疫情曾在德國北部造成了至少22人死亡。事件爆發后，科研人員借助于快速全基因組測序方法分析疫情，并開發出一種實時熒光定量PCR檢測試劑，精準地檢測食品中的毒性菌株。
德國STEC疫情發生后，全球多個研究團隊都在借助快速全基因組測序來分析疫情的爆發，詮釋其序列信息，并開發能夠從食物樣本中檢測到此菌株的特異性試劑。Life Technologies公司協助開發了一種解決方案，包括闡明最初序列信息到開發分離菌特異性檢測試劑的完整工作流程。在與多位臨床醫生和多家公共衛生中心的合作過程中，科研人員提供了互補性技術，并應用生物信息學知識加速了檢測試劑的開發。
初步序列鑒定
德國國立溶血性尿毒綜合癥咨詢實驗室的科研人員應用經典的血清學分型方法和基于Sanger測序法的毛細管電泳測序技術（CE），對該疫情致病因子的特征進行研究，并使用Applied Biosystem 3130基因分析儀進行多位點序列分型（MLST）研究。基于多條基因的序列片段，MLST技術能夠對分離菌進行鑒定。針對此次疫情的目標分離菌，選取的序列片段長度大約為450~500bp，覆蓋了每條基因，并以這些基因座上發現的等位基因定義了其特征和序列類型。通過比對此前鑒定的菌株的數據庫，得到假設性的鑒定結果。此次爆發的O104:H4菌株屬于ST678，與2001年分離到的2型志賀毒素（Stx2）陽性的O104:H4菌株（HUSEC41）屬于同一類型。
隨后，科研人員通過CE測序得到了800bp的Stx2基因，并藉此鑒定了其等位基因特征。通過這些初步信息，此序列被鑒定為大腸桿菌O104:H4，含有stx2和iha基因，但不含eae基因，能合成超廣譜β內酰胺酶（ESBL），對慶大霉素和氟喹諾酮敏感。
快速基因組測序
盡管完成了對菌株的初步鑒定，但要開發菌株特異性檢測試劑還有賴于全基因組測序。這種檢測試劑能夠快速檢測出受大腸桿菌O104:H4污染的食物，還能協助尋找傳染的源頭，對公共衛生策略和減少外交糾紛至關重要。
隨著新一代測序技術的到來，研究人員將能夠在短時間內獲得大量的序列信息。在使用Ion Torrent個人化操作基因組測序儀（PGM）進行測序之前，DNA序列首先被片段化，每條DNA片段都將在一個微粒上得到擴增（即克隆擴增）。在公共衛生重大疫情爆發中，樣本制備過程的簡化是至關重要的，而PGM測序工作流程正是如此。事實上，PGM能夠幫助研究人員在2h內得到高質量的基因組序列信息。另外，Ion 314芯片上的每個運行反應都能產生至少10Mb的高質量序列信息。整合上一步樣本制備過程，此測序技術能夠于一天之內提供完整的從DNA樣本制備到序列信息獲得的研究工作流程。
Ion PGM測序儀工作流程
通過聲波降解法，將純化后的細菌DNA進行片段化，得到各種約150bp的DNA片段。其他用于DNA片段化的方法（如機械剪切和酶剪切），也能通過隨機剪切得到類似長度大小的片段。依據標準化的Ion片段文庫制備試劑操作流程，分別使用1μg DNA，構建了該細菌的兩個文庫：一個文庫的片段平均長度為187bp；另一個的片段平均長度為211bp（包括接頭序列）。DNA片段被連接上Ion專用接頭序列，并在顆粒上得以擴增，進而使每個顆粒都擁有數千倍的單一片段克隆產物。隨后這些顆粒被載入到Ion 314芯片中，進行半導體測序，產生大約100bp的讀序（圖1）。使用兩套Ion PGM系統，可在2天之內運行10張314芯片。
所得讀序可通過重組裝或從頭組裝的方法進行拼接，這些讀序還可映射到菌株EDL933（包括質粒）基因組上，以評估通量。一旦完成測序即可組裝（Box1），得到了表1中的詳細結果。大腸桿菌O104:H4菌株LB226692基因組序列已經提交到NCBI中。該技術的真正威力是能夠在幾天之內獲得初步序列信息，這些序列信息有助于科研人員快速精準確定有毒菌株的特征。
德國明斯特大學附屬醫院衛生研究所科學家Alexander Mellmann博士評論：“快速全基因組測序結果讓我們在數天之內就發現了獨一無二的毒性特征組合，并獲知引起此次德國疫情爆發的大腸桿菌克隆類型是由不同大腸桿菌致病變種雜交而成的。”
分離菌特異性檢測試劑
國立溶血性尿毒綜合癥咨詢實驗室開發了一種基于凝膠電泳的終點法定量PCR檢測試劑（其中包含4對引物分別用于檢測4條基因，即stx2、terD、O104rfb和fliC H4）。通過分析PCR產物的大小，就可驗證這4條基因是否存在。
為了加快檢測過程和提高檢測通量，科研人員開發了一種實時熒光定量PCR檢測試劑，用于食品樣本中大腸桿菌O104:H4菌株的檢測（Box2）。這種基于TaqMan探針技術的檢測試劑堪稱食品污染檢測的絕佳選擇，因為它具備引物結合的高特異性和TaqMan探針結合及水解的高特異性（見圖2）。該試劑將能夠精準地檢測到食品中的毒性菌株，且不用擔心因相似菌株引起的假陽性干擾。此外，TaqMan檢測方法還具備高靈敏度和寬線性范圍（見圖3）。基于這新獲得的參照序列，科研人員加快設計開發的進程，TaqMan檢測試劑僅在1周之內就得以廣泛應用。
小結
應用快速全基因組測序方法和實時熒光定量PCR檢測試劑，可在2周內完成從臨床致病菌的離菌到特異性檢測試劑開發的整個過程，應用CE測序技術可進行最初的靶向檢測。Ion PGM測序儀的快速性和簡便性可在兩個不同地理區域內完成全基因組測序。Applied Biosystems 7500 Fast實時熒光PCR系統的速度和可靠性，及定制化TaqMan試劑的開發速度和高特異性能有效地監控大腸桿菌O104:H4疫情。