本文介紹了全自動離線二維液相色譜系統在分離復雜多肽混合物及混合蛋白質方面的應用
多維液相色譜在蛋白質組學研究領域中已成為一種成熟的用于分離復雜樣品的分離技術。結合離子交換與反相色譜的二維液相常以離線或在線的形式被用于蛋白及多肽的分離中。在線方式雖具有分析自動化程度較高等優點，但比較而言離線方式具有更佳的分離性能；更高的方法靈活性，能方便地針對每一維優化分離條件；對于蛋白質組學領域的研究者而言，更高的分離效率、更高的選擇靈活性意味著更寬闊的視野，更高的工作效率。
本文從蛋白質組學研究中最常見的兩種策略Bottom-up及Top-Down入手，介紹全自動離線多維液相色譜系統在蛋白質組學前端分離中的應用，包括分離復雜多肽混合物及混合蛋白質方面的應用。現在納升級液相色譜已在蛋白質組學研究領域中的地位非同一般，是蛋白質組學研究中質譜分析，特別是高端質譜分析的最佳前端分離工具。戴安公司（Dionex Corp.）是該領域的佼佼者，其納升及毛細管級液相產品源自荷蘭的LC-PACKING公司，LC-PACKING在分流技術領域有雄厚的研發實力，并于1998年就推出了第一臺納升級高效液相色譜。目前已推出基于UltiFlow技術的第三代分流裝置，使儀器的性能達到一個全新的高度，并在與不分流技術的競爭中處于絕對領先的地位。
最新的UltiMate3000全自動離線多維液相色譜系統配備了一套集進樣與餾分收集兩種功能于一身的進樣裝置（見圖1）；同時提供兩套獨立的梯度泵，分別用于第一維與第二維的分離；配以Cap或Nano分流器，極其方便地獲得從納升到毫升級別的流速范圍，使得用戶可以靈活地選擇不同類型以及不同級別的色譜柱，為方法開發帶來極高的便利，見表1。
圖 1. 自動進樣器的8通閥；同時用于進樣及餾分收集。
此外，戴安公司變色龍?軟件具有的2D-LC Plot功能可將二維的色譜圖按保留時間轉化成模擬二維電泳膠圖，方便使用者更直觀的分析數據。
CAP SCX / CAP Monolithic分離多肽
在本實驗中，兩維分離均采用毛細管色譜柱，這就意味著一個分流器需同時滿足兩維分離的需要，分流比為1:100，系統流路圖如圖2所示，通過程序控制的閥自動切換，完成整個離線二維從第一維的離子交換－餾分自動收集－第二維反相分離的全過程自動分析，分離結果如圖3、圖4所示。
圖2. 2D – Cap LC SCX-RP 的設置。
圖3. 多肽在第一維 SCX 柱上的分離。
圖4. 多肽餾份在第二維 PS-DVB 整體（Monolithic）反相柱上的分離。
2D-LC plot
復雜樣品通過二維液相色譜分離后獲得的三維數據(第一維分離時間-第二維分離時間-響應值)可根據保留時間轉化為以保留時間為橫、縱坐標的類似于電泳膠圖的2D-LC plot圖，結果見圖5。
圖5. SCX 餾份的 2D-LC Plot。
討論
全新的自動離線二維液相色譜系統為使用者提供了多種可選擇的分離模式組合，在極大的方便用戶進行方法開發的同時，也保證了每一維分離具有極高的分辨效率，為后期質譜鑒定提供更高的可信度（見表2），帶給研究者更豐富的樣品信息，這一點對于蛋白質組學研究領域的研究者而言尤為重要。同時，全自動的智能液相系統配以具有領先技術的整體（Monolithic）色譜柱，保證在每一維的分離過程中同時具備很高的分辨率與分析速度，大大節省了研究者的寶貴時間，提高了通量，以本實驗為例，完成含20個二維組分的分離總時間不到9h。
Micro WAX / CAP Monolithic分離蛋白
本實驗中，第一維分離采用弱陰離子交換，第二維采用Monolithic反相分離，系統流路圖如圖6所示，整個分析過程通過程序控制的閥門自動切換完成。分離結果如圖7、圖8所示，由二維色譜圖轉化為2D-LC plot圖如圖9所示。
圖 6. 2D-LC WAX-RP 的設置。
圖7. 蛋白在第一維 WAX 柱上的分離。
圖8. 蛋白餾份在第二維 PS-DVB 整體（Monolithic）反相柱上的分離。
圖9. WAX 餾份的 2D-LC Plot。
結論
以上實驗結果說明，全自動離線二維液相色譜系統能滿足蛋白質組學研究中多種分離模式的需要，配以具有極佳分離效率的離子交換系列色譜柱以及Monolithic系列整體柱，在能給研究者帶來更優異的分離效率的同時，減少了分析時間，是蛋白質組學研究前端理想的分離工具。