1.尿常規
常有明顯酮尿，是β-酮硫解酶缺乏癥的一個重要特征。
2.血氣分析
pH降低、[HCO3]降低、陰離子間隙增大等酸中毒表現。
3.生化測定
部分患者可有低血糖，少數患者血糖升高。一些患者血氨升高，肝功能損害。
4.血串聯質譜檢查
患者血液3-羥基異戊酰肉堿（C5OH）、乙酰肉堿（C2）、3-羥基丁酰肉堿（C4OH）及異戊烯酰肉堿（C5:1）等酰基肉堿增高，游離肉堿常不同程度降低。
5.尿有機酸分析
患者尿2-甲基-3-羥基丁酸、甲基巴豆酰甘氨酸及3-羥基丁酸升高，急性期明顯。
6.基因檢測
ACAT1基因檢測是確診的重要方法，亦有助于鑒別診斷。