一期梅毒的診斷主要根據接觸史、潛伏期、典型臨床表現，同時結合實驗室檢查（暗視野顯微鏡、鍍銀染色、吉姆薩染色或直接免疫熒光檢查發現TP；梅毒血清試驗早期陰性，后期陽性），應注意不可僅憑借一次梅毒血清學試驗陰性結果排除梅毒。硬下疳應與生殖器皰疹、軟下疳、白塞病和固定性藥疹等進行鑒別：
1.生殖器皰疹
典型表現為生殖器部位簇集性小水皰，自覺癢痛，不硬，1～2周后可消退，但易復發，組織培養為單純皰疹病毒，Tzank涂片檢查陽性，PCR檢測皰疹病毒DNA為陽性。
2.下疳樣膿皮癥
病原菌為金黃葡萄球菌或鏈球菌，皮損形態與硬下疳類似，但無典型軟骨樣硬度，周圍無暗紅色浸潤，無不潔性交史，梅毒螺旋體檢查陰性，附近淋巴結可腫大，但皮損愈后即消退。
3.軟下疳
亦有性接觸史，由杜克雷嗜血桿菌引起，潛伏期短，發病急，炎癥顯著，疼痛，性質柔軟，皮損常多發，表面有膿性分泌物，可檢見杜克雷嗜血桿菌，梅毒血清試驗陰性。
4.結核性潰瘍
亦多見于陰莖、龜頭，皮損亦為單發孤立淺表性圓形潰瘍，表面常有結痂，自覺癥狀輕微，可檢見結核桿菌，常伴有內臟結核。
5.貝赫切特綜合征
可在外陰部發生潰瘍，女性亦可見于陰道、子宮頸，潰瘍較深，有輕微瘙癢，損害無硬下疳特征，常繼發口腔潰瘍、眼損害（虹膜睫狀體炎、前房積膿等）、小腿結節性紅斑及游走性關節炎等，梅毒血清反應陰性。
7.固定性藥疹
為藥物性皮炎的一種，可見于外生殖器處，為鮮紅色紅斑，可形成淺表性糜爛，自覺癢、不痛、無硬下疳特征，有服藥史，梅毒血清反應陰性。