在工業生產中，丙酮-丁醇發酵常用的菌種有：以淀粉發酵為主的丙酮-丁醇梭菌，細胞中具有淀粉酶，不需要預先糖化就可以直接發酵；另一種是用于糖蜜、纖維素水解液或亞硫酸紙漿廢液等糖質原料發酵的糖丙酮-丁醇梭菌，為嚴格的厭氧細菌，特別是在芽孢出芽階段。梭菌傳代培養多次以后，菌種的發酵能力往往減弱，所以常用加熱菌種芽孢懸液（100℃，1～2分鐘）的辦法，保持和提高菌種的發酵力。
淀粉質原料含有梭菌生長必需的全部營養物質，糖蜜原料中缺乏氮源，可用動物或植物蛋白或無機氮加以補充。碳水化合物的濃度對梭菌的生長無明顯影響，但丁醇濃度達到1.5%時，對發酵產生毒害，如果把丁醇濃度不斷稀釋并控制在1.5%以下，發酵即可正常進行。固定化細胞生產丁醇已取得良好結果，將梭菌細胞固定在藻酸鈉膠體顆粒上，進行生物化學反應，產物以丁醇為主，丁醇產率至少可保持1周不變。