對真核生物來說，組成丙酮酸去氫酶復合物的三種酶及五種輔酶皆位在線粒體中；對原核生物來說，則是位在細胞質里。這些酶除了組合在一起之外，還能夠重復地組成更大的蛋白質群。
組成丙酮酸去氫酶復合物的三種酶分別是：丙酮酸去氫酶、二氫硫辛酰基乙酰基轉基酶、二氫硫辛酰基去氫酶。五種輔酶則是：硫胺素焦磷酸、輔酶A、硫辛酸、黃素腺嘌呤雙核苷酸、煙堿胺腺呤雙核苷酸。
硫胺素焦磷酸（TPP）位在在E1的活化位置上，其主要構造是噻唑環（thiazole ring ），組成TPP的必要物質是硫胺素（也就是維生素B1）。
E2含有三種功能不同的區域，第一個區域稱為硫辛酰區（Lipoyl domain），位在E2蛋白質的氨基端（N-terminal）上。硫辛酸形成的硫辛酰基（Lipoyl group）與離胺酸形成的離胺酸殘基（residue）會組成硫辛酰基離胺酸，是E2的輔成基。這個區的數目在依照物種的不同而有變異。第二個區域是負責E2與E3、以及E2與E1之間連結的區域，稱為連接區（Binding domain）。第三個區域最靠近復合物內部，稱為乙酰基轉移酶區（acyltransferase domain），能使乙酰基轉移。不同區域之間會相隔20到30個不等的氨基酸。
E3上則有黃素腺嘌呤雙核苷酸（FAD），而組成FAD的主要物質，是核黃素（維生素B2）。另外NAD中含有煙堿酸（維生素B3），CoA的組成物之一則是泛酸（Pantothenate；維生素B5）。