MAPK的活性被認為是由活化環的氨基酸序列中的雙磷酸化位點所調控。MAPK活化環中的TXY序列是特定的MKK催化進行雙磷酸化反應的位點。對于ERK/ERK2來說，雙磷酸化位點是Thr183和Tyr185。這些位點的雙磷酸化使MAPK的活性增加一千倍以上。 [1]
MAPK在它們的堿形式中是沒有催化活性的。為了變得活躍，它們需要它們的活化環中發生（可能多個）磷酸化事件。這是由STE蛋白激酶組的專門酶進行的。
在經典MAP激酶的情況下，活化環包含一個特征性的TxY (蘇氨酸-x-酪氨酸) motif (哺乳動物ERK1和ERK2中的TEY，ERK5中的TDY，JNK中的TPY，p38激酶中的TGY)，為了把激酶結構域鎖定在一個有催化活性的構象上，需要在蘇氨酸和酪氨酸兩個殘基上都進行磷酸化。在體內和體外，酪氨酸的磷酸化常常先于蘇氨酸的磷酸化，盡管任一殘基的磷酸化都可以在沒有另一殘基的情況下發生。
這個串聯活化環的磷酸化由Ste7蛋白激酶家族的成員，也就是MAP2激酶來執行。MAP2激酶又由許多不同的上游絲氨酸蘇氨酸激酶（MAP3激酶）磷酸化激活。由于MAP2激酶在其同源MAPK以外的底物上顯示非常小的活性，經典MAPK通路形成多層次，但相對線性的信號通路。這些信號通路可以有效地將刺激從細胞膜（在這里許多MAP3K被激活）傳遞到細胞核（只有MAPK可以進入核內）或許多其他的亞細胞靶點。
與三層的經典MAPK通路相比，一些非典型MAP激酶似乎具有更古老的兩層系統。ERK3(MAPK6)和ERK4(MAPK4)最近被證明是被直接磷酸化的，因此被PAK激酶(與其他MAP3激酶相關)激活。與經典的MAP激酶相比，這些非典型MAPK只需要在它們的活化環中有一個殘基被磷酸化。NLK和Erk7（MAPK15）激活的細節尚不清楚。