從培養組織中分離單細胞指將愈傷組織反復繼代培養，再轉移至液體培養基振蕩培養。這是獲得單細胞使用最廣泛的一種方法。將表面消毒后的植物器官新鮮切片放置在培養基(固體)上，培養基含適當比例的生長素和細胞分裂素，以保證組織培養的順利進行。外植體切口處形成愈傷組織，逐漸生長擴展到外植體組織的整個表面。將愈傷組織從外植體上分離，轉移到成分相同的新鮮培養基上，促使愈傷組織生長。在瓊脂培養基上反復繼代培養，使愈傷組織結構疏松，為建立優質細胞懸浮系打下基礎。液體培養基分裝在經高壓滅菌后的三角瓶或其他培養瓶中，轉入未分化和疏松的愈傷組織塊。然后，將三角瓶或培養瓶置于臺式搖床或適宜設備上，持續振蕩培養。振蕩培養的培養基對愈傷組織塊產生適度的壓力，將愈傷組織分離成游離單細胞和小細胞團。此外，加強培養基和培養瓶內空氣之問的氣體交換，并使培養基中細胞和細胞團分布均勻。