植物體細胞雜交是在原生質體培養技術的基礎上,借用動物細胞融合方法發展起來的一門新型生物技術。植物體細胞雜交的過程包括原生質體的制備,原生質體融合的誘導,雜種細胞的篩選和培養,以及雜種植株的再生與鑒定等環節。下面以煙草和大豆的體細胞雜交為例,簡要介紹植物體細胞雜交的過程。
原生質體制備選取煙草植株上的幼嫩葉片和培養好的大豆細胞,用酶解法制備原生質體。煙草的原生質體呈綠色,大豆的無色,在顯微鏡下很容易將二者區別開來。
原生質體融合取等量的煙草和大豆的原生質體混合后,加入聚乙二醇溶液。在顯微鏡下觀察,可以看到原生質體相互黏集在一起。隔一段時間后,加入高鈣、高pH的溶液,這時原生質體才開始融合。原生質體融合包括膜融合和核融合兩個過程。誘導融合只能誘導細胞膜的融合,兩個核的融合是在雜種細胞第一次有絲分裂時進行的。
雜種細胞的篩選和培養煙草與大豆的原生質體融合后,將原生質體轉移到適當的培養基上培養,使原生質體再生出細胞壁。這時,在細胞混合物中,不僅有煙草—大豆雜種細胞,還有煙草細胞、大豆細胞、煙草—煙草細胞、大豆—大豆細胞。雜種細胞的篩選,可以用機械方法,也可以用生理學或遺傳學的方法。以機械方法為例,根據兩種親本細胞在形態、色澤上的差異,將細胞分別接種在帶有小格的培養皿中,每個小格中約放1~3個細胞。在顯微鏡下找出雜種細胞,并且標定位置。等雜種細胞分裂成細胞團時,轉移到培養皿中,培養成愈傷組織。
雜種植株的再生與鑒定雜種植株的再生是指從愈傷組織培養出雜種植株的過程。由于煙草和大豆分別屬于茄科和豆科,二者的原生質體融合后,至今只能長成雜種愈傷組織,還不能分化,因此談不上雜種植株的再生和鑒定。對于能夠再生出雜種植株的,如煙草—海島煙草、白菜—甘藍、胡蘿卜—羊角芹等,長出的植株究竟是不是雜種,還需要經過鑒定才能確定下來。雜種植株的鑒定方法有形態學方法、生化方法(如電泳)、細胞學方法(如染色體組型分析)、分子生物學方法(如分子雜交)等