第一類內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中沒有多大用處，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第二類內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、9個、10個和11個核苷酸的。如果識別位置在DNA分子中分布是隨機的，則識別4個核苷酸的限制性內切酶每隔46（4096）個核苷酸就有一個切點。人的單倍體基因組據估計為3×199核苷酸，識別4個核苷酸的限制性內切酶的切點將有（3×109/2.5×102）約107個切點，也就是可被這種酶切成107片段，識別6個核苷酸的限制性內切酶也將有（3×109/4×103）約106個切點。第三類內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對于克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。