內肽酶，也就是通常所說的蛋白酶，主要作用于蛋白質多肽鏈內部的肽鍵使蛋白質長鏈分解成短肽片段。蛋白酶根據結構同源性分為不同的宗族，亞類進一步根據序列同源性程度分為不同的家族。
蛋白酶水解蛋白質時，作用部位因肽鍵種類而異。如胰蛋白酶的切點是羧基側為堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）肽鍵；胃蛋白酶要求切點兩端有芳香族氨基酸；枯草桿菌堿性蛋白酶要求切點的羧基側為疏水性芳香族氨基酸（ 色氨酸、酪氨 酸、苯丙氨酸）。這種蛋白酶對切點的特異性要求叫做蛋白酶的底 物專一性。利用蛋白酶的底物專一性可以定向獲得特殊結構的多肽。