各物質在兩相中擴散速度不同，產生不同的分配系數。分配層析分離技術是利用各物質不同分配系數，使混合物隨流動相通過固定相時而予以分離的方法。
分配系數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達到平衡時，該溶質在兩相溶劑中所具濃度的比例。不同物質因其性質不同而有不同的比例，也就是有不同的分配系數。現在應用的分配層析技術，大多數是以一種多孔物質吸著一種極性溶劑，此極性溶劑在層析過程中始終固定在此多孔支持物上而被稱為固定相。另用一種與固定相不相溶的非極性溶劑流過固定相，此移動溶劑稱為流動相。如果有多種物質存在于固定相和流動相之間，將隨著流動相的移動進行連續的、動態的不斷分配，由于各種物質的分配系數相近，移動距離就必須相當長才能分開。反之，兩種物質的分配系數相差越大，彼此分開時的移動距離就越短。因此，必須根據實際情況，選定作為固定相用的層析柱或濾紙的長度。
分配層析中應用最廣泛的是以濾紙為多孔支持物的紙上分配層析。其次是以硅膠、硅藻土、纖維素粉、淀粉、微孔聚乙烯粉等多孔支持物的分配層析。還有直接使物質在兩種不相溶的溶劑中進行分配的常壓液相分配層析和高壓液相分配層析。
分配層析以分配系數為依據，在等溫等壓條件下可用下式表示。K=K2/K1，式中K為分配系數；K2是物質在固定相中的濃度； K1是物質在流動相中的濃度。分配系數與溫度、溶質和溶劑的性質有關，各種物質有不同的分配系數。