大腸桿菌 為革蘭陰性短桿菌，因可分解乳糖而產酸，菌落在SS、中國藍及伊紅美藍平板上分別呈紅色、藍色及紫黑色，借此可與沙門菌及志賀菌相鑒別，但應注意少數菌株分解乳糖緩慢。本菌屬能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產酸、產氣，不分解蔗糖。靛基質 (吲哚)、甲基紅、VP及枸椽酸鹽（IMVC）試驗分別呈+ + --，尿素酶陰性，不產H2S。
大腸桿菌0抗原已知者有160余種，是分群的基礎，腸桿菌科不同屬細菌間可有共同的0抗原。H抗原和K抗原各約50和90余種，K抗原又可分為L、A、B組。根據DNA同源性分析結果，新的屬于大腸桿菌屬者尚有E.blattae和E.hermannii等。
大腸桿菌在土壤和水中可生存數月，在含氯的水中不能生存。對很多常用抗菌素耐藥，多數為自然耐藥，另一些則由質粒介導而獲得。