1.患兒側臥位，一助手立于對側扶持固定其手足，另一助手坐于患兒的頭側，雙手分別固定患兒頭部和軀干，使頭頸略向前彎，與頸部、軀干方向一致。
2.以枕骨粗隆與第2頸椎棘突間凹陷的正中處為穿刺點，對準眉間的方向刺入皮膚軟組織。
3.下一步穿刺有3種方法
（1）熟練操作者穿刺針進入軟組織后，右手持針繼續前進，左手不動，待阻力感消失（有突破感）時拔出針芯，可見腦脊液流出。
（2）當穿刺針進入外層組織后即拔出針芯，用雙手拇指與示指扶穩穿刺針的接頭，穩步前進，其他手指撐在患兒頭頸部，以免針尖突進過深。當針尖剛進入延髓池時，即見腦脊液流出。
（3）開始程序同前，然后用雙手拇指與中指持針，兩示指分別撐在患兒的頭頸部，方向不變徐徐前進，阻力感消失時，拔出針芯，也可先取掉針芯，視患兒具體情況而定。一般刺入深度為2～3cm，依患兒胖瘦而異。
4.留取腦脊液后無菌紗布壓迫拔針，局部再次消毒，再以無菌紗布覆蓋，膠布固定。