基因工程涉及眾多的工具酶可粗略的分為限制酶，連接酶，聚合酶，核酸酶和修飾酶五大類。其中，以限制性核酸內切酶和DNA連接酶在分子克隆中的作用最為突出。
DNA限制性內切酶：
生物體內能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，并在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸，五核苷酸，八核苷酸和六核苷酸，其中以六核苷酸為主，其序列旋轉對稱。切口分黏性末端和平末端，產生3′－OH和5′－P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。