1、微生物染色— 待檢菌菌齡應為18-24小時。一般情況下，革蘭氏陰性菌的染色反應較為穩定，不易受菌齡的長短影響；而革蘭氏陽性菌，有的在幼齡時呈陽性，超過24小時可變為陰性。故培養物越陳舊，菌細胞衰老、死亡，則染色常為陰性，造成錯判。
2、微生物染色— 涂片以勻薄為佳，切不可濃厚。過于密集的菌體，因洗脫不勻常呈假陽性。鏡檢革蘭氏染色反應時，要以分散開的細菌著色為準。涂片后不宜用火焰烤干，宜自然干燥；若經火焰固定時，應以不燙手為度，以免菌體受損，致使染色反應不準。
3、微生物染色— 革蘭染色操作的關鍵步驟是對脫色的掌握，脫色時間不足，革蘭氏陰性菌可染成陽性菌；脫色過度，革蘭陽性菌會染成陰性菌。故應注意掌握，以無紫色脫出時立即水洗。脫色時間按涂沫厚薄、涂片含水量多少適當掌握，涂沫厚、涂片含水少（水洗后瀝干水分）時，脫色時間稍長；涂沫薄、涂片含水量多（未瀝干）時，脫色時間稍短，在20-30秒內調整。
4、微生物染色— 碘液配制后，應裝在密閉的暗色瓶內儲存。如因儲存不當，部分碘將被揮發或被還原，試液由原來的紅棕色變為淡黃色，以至影響固定甲紫的作用，故不宜再用。
5、微生物染色— 革蘭氏染色能否獲得滿意的結果，與操作者的經驗有很大關系。操作沒有把握或對染液有懷疑時，應以對照菌同時染色。