腫瘤為質硬、白色組織。通常可見散在的魚肉樣或出血區域。如果術前用四環素對腫瘤進行標記，則比較容易確定腫瘤的髓內范圍、衛星結節、跳躍灶、骨骺受侵范圍或經由關節內韌帶所致的關節受侵。
當化療效果滿意時，大體標本上可以看到韌/硬的腫瘤組織被柔軟的、凝膠狀退化的組織所取代。殘存腫瘤的部位呈現熒光亮區，而壞死退變的組織不與四環素或熒光物質結合。
典型成骨源性肉瘤由高度惡性的梭形細胞構成，在腫瘤細胞的周圍產生骨樣基質。腫瘤性骨不成熟，形狀不規則，且不按應力方向排列。常可見軟骨和（或）纖維分化區。腫瘤骨可充填骨髓腔而不破壞相鄰的骨小梁，X線表現為“成骨”改變 。
鏡下，腫瘤內有骨樣基質產生是診斷成骨源性肉瘤的必要條件。典型成骨源性肉瘤一般為3級或4級，核有異形性，深染以及較多的核分裂象。典型成骨源性肉瘤有3個組織亞型：骨母細胞型、軟骨母細胞型和成纖維細胞型。骨母細胞型成骨源性肉瘤有豐富的骨樣基質，有的呈花邊樣，有的呈粗大的小梁骨樣。軟骨母細胞型成骨源性肉瘤產生軟骨，成纖維細胞型成骨源性肉瘤形成梭形細胞基質同時伴有局灶的骨樣基質。
有時病灶未分化而很難診斷時，可用堿性磷酸酶染色進行診斷。如果大部分的腫瘤細胞呈陽性反應就能支持該診斷。
化療后可能會出現大量的壞死和反應骨形成的包殼。在鏡下，90%以上的腫瘤組織發生壞死才被稱作化療效果滿意。有近2/3的典型成骨源性肉瘤病例，其術前化療效果滿意 。