根據上述典型的體征，結合心電圖、胸部X線和心臟超聲檢查，診斷房間隔缺損一般并無困難。對于非典型的患者或疑有其他合并畸形者，心導管檢查可提供幫助。需與房間隔缺損相鑒別的病癥主要有單純肺動脈瓣狹窄、原發性肺動脈擴張。
1.單純肺動脈瓣狹窄的肺動脈瓣區收縮期雜音性質粗糙、響亮，并常可捫及震顫，肺動脈瓣區第二心音減弱甚至消失。胸部X線片可見肺動脈段明顯突出，但肺血少于正常或在正常范圍，心臟超聲檢查可明確診斷。右心導管檢查右心房與腔靜脈血氧含量無顯著差異，右心室與肺動脈壓力階差超過20mmHg。
2.原發性肺動脈擴張也可在肺動脈瓣區聽到Ⅱ級收縮期雜音，胸部X線片可有肺動脈段突出，但肺血正常，心臟超聲檢查房間隔無回聲中斷和分流，右心導管檢查右心房、右心室無血氧含量改變，右心室和肺動脈間無壓力階差。