衣原體眼病的最佳診斷方法是組織培養中分離到沙眼衣原體.用棉拭子或Dacron拭子擦磨翻開的下眼瞼粘膜取得分泌物作培養.直接單克隆抗體試驗從膿性分泌物涂片中檢測衣原體，和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對結膜培養中的衣原體檢測很敏感且有特異性.
淋病性眼炎必須除外淋球菌感染，診斷的第1步驟是結膜分泌物培養和革蘭氏染色，培養需要放入合適的培養基（如Thayer-Martin）來分離淋球菌.顯微鏡下細胞內革蘭氏陰性，咖啡豆形雙球菌提示淋球菌性感染.革蘭氏染色檢查還可幫助鑒別其他細菌.在衣原體感染時，結膜分泌物涂片應該顯示為顯著的單核細胞反應,而無細菌.
皰疹性角膜結膜炎通過病毒分離可確診，對結膜分泌物作免疫熒光HSV-Ⅰ型或HSV-Ⅱ型抗原測定，或通過電子顯微鏡確定HSV顆粒.特異性診斷事關重大，因為疾病可蔓延至中樞神經系統和其他器官。