⒊吸附劑的活度及其調節
吸附劑的吸附能力常稱為活度或活性。吸附劑的活性取決于它們含水量的多少，活性最強的吸附劑含有最少的水。吸附劑的活性一般分為五級，分別用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V表示。數字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ和Ⅲ。向吸附劑中添加一定的水，可以降低其活性；反之，如果用加熱處理的方法除去吸附劑中的部分水，則可以增加其活性，后者稱為吸附劑的活化。
⒋吸附劑和洗脫劑的選擇
樣品在色譜柱中的移動速度和分離效果取決于吸附劑對樣品各組分的吸附能力大小和洗脫劑對各組分的解吸能力大小，因此，吸附劑的選擇和洗脫劑的選擇常常是結合起來進行的。首先，根據待分離物質的分子結構和性質，結合各種吸附劑的特性，初步選擇一種吸附劑。然后根據吸附劑和待分離物質之間的吸附力大小，選擇出認為適宜的洗脫劑。最后，采用薄層色譜法進行試驗。根據試驗結果，再進一步決定是調節吸附劑的活性，還是更換吸附劑的種類，或是改變洗脫劑的極性。直到確定出合適的吸附劑和洗脫劑為止。
物質與吸附劑之間的吸附能力大小既與吸附劑的活性有關，又與物質的分子極性有關。分子極性越強，吸附能力越大，分子中所含極性基團越多，極性基團越大，其吸附能力也就越強。具有下列極性基團的化合物，其吸附能力按下列次序遞增：
-Cl，-Br，-I<-C=C-<-OCH3<-CO2R<-CO-<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-COOH
四、操作方法
⒈裝柱
色譜柱的大小規格由待分離樣品的量和吸附難易程度來決定。一般柱管的直徑為0.5～l0 cm，長度為直徑的10～40倍。填充吸附劑的量約為樣品重量的20～50倍，柱體高度應占柱管高度的3/4，柱子過于細長或過于粗短都不好。裝柱前，柱子應干凈、干燥，并垂直固定在鐵架臺上，將少量洗脫劑注入柱內，取一小團玻璃毛或脫脂棉用溶劑潤濕后塞入管中，用一長玻璃棒輕輕送到底部，適當搗壓，趕出棉團中的氣泡，但不能壓得太緊，以免阻礙溶劑暢流 （如管子帶有篩板，則可省略該步操作）。再在上面加入一層約0.5 cm厚的潔凈細砂，從對稱方向輕輕叩擊柱管，使砂面平整。
常用的裝柱方法有干裝法和濕裝法兩種。
⑴干裝法：在柱內裝入2/3溶劑，在管口上放一漏斗，打開活塞，讓溶劑慢慢地滴入錐形瓶中，接著把干吸附劑經漏斗以細流狀傾瀉到管柱內，同時用套在玻璃棒 （或鉛筆等）上的橡皮塞輕輕敲擊管柱，使吸附劑均勻地向下沉降到底部。填充完畢后，用滴管吸取少量溶劑把粘附在管壁上的吸附劑顆粒沖入柱內，繼續敲擊管子直到柱體不再下沉為止。柱面上再加蓋一薄層潔凈細砂，把柱面上液層高度降至0.1～l cm，再把收集的溶劑反復循環通過柱體幾次，便可得到沉降得較緊密的柱體。
⑵濕裝法：基該方法與干裝法類似，所不同的是，裝柱前吸附劑需要預先用溶劑調成淤漿狀，在倒入淤漿時，應盡可能連續均勻地一次完成。如果柱子較大，應事先將吸附劑泡在一定量的溶劑中，并充分攪拌后過夜 （排除氣泡），然后再裝。無論是干裝法，還是濕裝法，裝好的色譜柱應是充填均勻，松緊適宜一致，沒有氣泡和裂縫，否則會造成洗脫劑流動不規則而形成“溝流”，引起色譜帶變形，影響分離效果。
⒉加樣
將干燥待分離固體樣品稱重后，溶解于極性盡可能小的溶劑中使之成為濃溶液。將柱內液面降到與柱面相齊時，關閉柱子。用滴管小心沿色譜柱管壁均勻地加到柱頂上。加完后，用少量溶劑把容器和滴管沖洗凈并全部加到柱內，再用溶劑把粘附在管壁上的樣品溶液淋洗下去。慢慢打開活塞，調整液面和柱面相平為止，關好活塞。如果樣品是液體，可直接加樣。
⒊洗脫與檢測
將選好的洗脫劑沿柱管內壁緩慢地加入柱內，直到充滿為止 （任何時候都不要沖起柱面覆蓋物）。打開活塞，讓洗脫劑慢慢流經柱體，洗脫開始。在洗脫過程中，注意隨時添加洗脫劑，以保持液面的高度恒定，特別應注意不可使柱面暴露于空氣中。在進行大柱洗脫時，可在柱頂上架一個裝有洗脫劑的帶蓋塞的分液漏斗或倒置的長頸燒瓶，讓漏斗頸口浸入柱內液面下，這樣便可以自動加液。如果采用梯度溶劑分段洗脫，則應從極性最小的洗脫劑開始，依次增加極性，并記錄每種溶劑的體積和柱子內滯留的溶劑體積，直到最后一個成分流出為止。洗脫的速度也是影響柱色譜分離效果的一個重要因素。大柱一般調節在每小時流出的毫升數等于柱內吸附劑的克數。中小型柱一般以1～5滴/秒的速度為宜。
洗脫液的收集，有色物質，按色帶分段收集，兩色帶之間要另收集，可能兩組分有重疊。對無色物質的接收，一般采用分等份連續收集，每份流出液的體積毫升數等于吸附劑的克數。若洗脫劑的極性較強，或者各成分結構很相似時，每份收集量就要少一些，具體數額的確定，要通過薄層色譜檢測，視分離情況而定。至2018年，多數用分步接受器自動控制接收。
洗脫完畢，采用薄層色譜法對各收集液進行鑒定，把含相同組分的收集液合并，除去溶劑，便得到各組分的較純樣品。