核酸內切酶催化水解多核苷酸內部的磷酸二酯鍵。有些核酸內切酶僅水解5′磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在3′位置上，稱為5′-內切酶；而有些僅水解3′-磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在5′位置上，稱為3′-內切酶。還有一些核酸內切酶對磷酸酯鍵一側的堿基有專一要求，例如胰臟核糖核酸酶（RNaseA）即是一種高度專一性核酸內切酶，它作用于由嘧啶核苷酸C‘3處的羥基與下一個核苷酸C5’處的磷酸形成的3‘，5’-磷酸二脂鍵，產物為以3′嘧啶核苷酸結尾的低聚核苷酸和以5’核苷酸開頭的低聚核苷酸。
