因為，色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的增加，會出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰的現象，一般來說是柱效的下降。
1.反向柱的再生：
依次采用20～30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90(V/V)，乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
2.正相柱的再生：
依次以20～30倍的色譜柱體積正己烷、異丙醇(異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高)、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意以上溶劑必須嚴格脫水。
3.離子交換柱的再生：
長時間在緩沖溶液中使用和進樣，將導致色譜柱離子交換能力下降。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
特別說明：
再生過程必須隨時關注柱壓變化，柱壓過高易導致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時要保證再生時間足夠。再生時最好選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統色譜儀器進行，以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。