作為一些酶的輔基而起輔因子作用。它以共價鍵的形式通過酰胺鍵和脫輔基酶蛋白的一個專一賴氨酰殘基的ε -氨基相連。ε-N-生物素酰-L-賴氨酸稱為生物胞素(biocytin)。
需要生物素的酶類能催化二氧化碳的參入 (羧化作用)或轉移，因而生物素和二氧化碳的固定密切相關。在羧化作用時還需要腺苷三磷酸(ATP)和鎂離子的存在，此外生物素在蛋白質生物合成中以及轉氨基作用中也起著重要作用。
