紙上分配層析是以濾紙為惰性支持物的。濾紙纖維和水有較強的親和力，能吸收22%的水，而且其中6～7%的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基結合，在一般條件下較難脫去。而濾紙纖維與有機溶劑的親和力甚弱，所以一般的紙上分配層析實際上是以濾紙纖維及其結合水作為固定相，以有機溶劑作為流動相。當有機相沿紙經過樣品點時，樣品點上的溶質在水相和有機相之間進行分配，一部分溶質離開原點隨有機相移動，進入無機溶質區，此時又重新進行分配，一部分溶質從有機相移入水相。當有機相不斷流動時，溶質也就不斷進行分配，沿著有機相方向移動。溶質中各種不同組分有不同的分配系數，移動速率也不相同，從而使物質得以分離和提純。
溶質在紙上移動的速率可用Rf值表示。 Rf值決定于被分離物質在兩相間的分配系數和兩相間的體積比。由于兩相體積比在同一實驗條件下是一常數，所以Rf值主要決定因素是分配系數，不同物質分配系數不同，Rf值也不同。